[发明专利]绿鲍与皱纹盘鲍杂交种的二步PCR分子鉴定方法

摘要

绿鲍与皱纹盘鲍杂交种的二步PCR分子鉴定方法，涉及一种鲍的DNA分子标记检测。(1)采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取绿鲍、皱纹盘鲍及其杂交子一代基因组DNA；(2)以所提取的基因组DNA为模板进行多重PCR和常规PCR的平行扩增；(3)PCR扩增反应程序为：多重PCR反应程序和常规PCR反应程序；(4)对两个PCR反应扩增产物分别进行凝胶电泳；(5)将电泳图谱与标准图谱进行比对；(6)对电泳结果图谱进行分析。利用绿鲍和皱纹盘鲍线粒体基因和核基因的种间特异性位点，检测时间短、结果直观，检测成本低、检测技术易于操作，可准确、简单、快捷的对杂交种的真伪进行检测，具有应用和推广价值。

主权项

绿鲍与皱纹盘鲍杂交种的二步PCR分子鉴定方法，其特征在于其具体步骤如下：(1)采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取绿鲍、皱纹盘鲍及其杂交子一代基因组DNA；(2)以所提取的基因组DNA为模板进行多重PCR和常规PCR的平行扩增；多重PCR扩增采用两对特异性引物：引物1：afa142F：CCGTTGAACATGCTCACAGTAR：TAATGGGCACATTCCGTAAAT引物2：DF‑1F：ATCTCAATTAGTGCGACATCACR：CCAGAGCAAACTGATCGACTG常规PCR扩增中采用的特异性引物：引物：DF‑2F：TTCTCTGTTAATTTGTGTGGR：CCGGTCTGAACTCAGATCACGT；(3)PCR扩增反应程序为：多重PCR反应程序：94℃3min→{94℃30s→[65℃→55℃每个循环降低0.5℃]→72℃20s}×20→{94℃30s→55℃30s→72℃15s}→72℃10min→4℃∞；常规PCR反应程序：94℃3min→{94℃30s→54℃30s→30℃30s}×30→72℃10min→4℃∞；(4)对两个PCR反应扩增产物分别进行凝胶电泳；(5)将电泳图谱与标准图谱进行比对；(6)对电泳结果图谱进行分析，其中：多重PCR中，由引物1扩增出的目的条带为大小在250bp左右皱纹盘鲍特异性的条带，记为条带1‑1，由引物2扩增出的目的条带为大小在500～750bp之间的绿鲍特异性条带，记为条带1‑2；常规PCR中，扩增出的产物是条带为大小在250bp左右的特异性条带，记为条带2‑1；将电泳结果于可见灯箱下观察拍照；电泳图谱进行比对后，只具有条带1‑1的DNA样品，即为皱纹盘鲍样品；只具有条带1‑2的DNA样品，即为绿鲍样品；同时具有条带1‑1及条带1‑2的样品，即同时具有亲本皱纹盘鲍和亲本绿鲍的特异性条带，说明该个体系二者的杂交种；具有条带2‑1的DNA样品，即含有绿鲍线粒体基因特异性片段的DNA样品，能判断是绿鲍样品或以绿鲍为母本的杂交子代；不具有任何条带的DNA样品，即不含有绿鲍线粒体基因特异性片段的DNA样品，能判断是皱纹盘鲍样品或以皱纹盘鲍为母本的杂交子代；同时，具有条带1‑1，条带1‑2，条带2‑1的DNA样品，说明是以绿鲍为母本，皱纹盘鲍为父本的杂交后代，只具有条带1‑1及条带1‑2的DNA样品，说明是以皱纹盘鲍为母本，绿鲍为父本的杂交后代。