[发明专利]一种农田土壤中漆酶活性测定方法

摘要

本发明公开了一种农田土壤中漆酶活性测定方法，本发明在传统分光光度法检测漆酶活性的基础上，通过确定土壤漆酶活性的最适pH、缓冲液、底物、土壤漆酶浸提液三者的添加比例、紫外分光光度计扫描时间，建立了一种简便、稳定、重现性较好的农田土壤漆酶活性测定方法。该方法适用性广，适合于旱地、水田、水旱轮作、菜园、果园等农田土壤样品中漆酶活性测定，其操作简便、快速，技术要求相对较低，适合大批量样品的分析测定。

主权项

一种农田土壤中漆酶活性测定方法，其步骤如下：A、土壤漆酶浸提液的提取(1)称取3～5g待测土壤样品于无菌离心管中，加6ml50mM pH＝7.1的磷酸缓冲液，涡旋混匀，每个样品三次平行；(2)于室温超声波水浴10～20min；(3)4000～8000×g离心10～20min，收集上清液，获得土壤漆酶浸提液，置于4℃保存待用；B、漆酶活性测定(1)最适pH值的确定①采用电位法测定一批土地利用方式一致的土壤样品的pH值，水土比为2.5:1，v:w，将pH相近的土壤样品归为一类，同时选其中pH居中的样品用于测定该类土壤中漆酶的最适pH；②配制步骤①中选取的土壤样品pH±2范围内的所有伯瑞坦‑罗比森缓冲液；③测定前将土壤漆酶浸提液置于25～30℃水浴中20～30min以恢复酶活性，测定时环境温度保持25～30℃；同时，做两个阴性对照，分别为无反应底物2,2‑联氮基‑双‑(3‑乙基苯并噻唑啉‑6‑磺酸)二氨盐对照和热变性漆酶浸提液对照；④以双蒸水为空白，在紫外分光光度计上420nm处校零，将B‑R缓冲液、底物30mM ABTS溶液、漆酶浸提液按17:2:1(v:v:v)的比例添加到离心管至终体积3mL，迅速混匀后，倒入比色皿内，立即放入紫外分光光度计，并扫描5min，每个平行样品测定四次；⑤待测液中漆酶酶活性的计算：以U/L表示酶活性浓度，用连续监测法测定在线性范围内每分钟吸光度的变化(ΔA/Δmin)计算：式中：V为反应体系体积，ml；ε为摩尔消光系数，cm².mol^‑1；v为样品量，ml；L为比色杯光径cm；ΔA为计时开始到最大吸光值时吸光度变化；Δmin为吸光值最大与最小时的时间差；10⁶为将mol换算成μmol；每克干土中漆酶活性＝酶活性浓度/干土质量；⑥扫描曲线平滑、完整且酶活性最大时对应的伯瑞坦‑罗比森缓冲液的pH值为该土壤漆酶的最适pH值，同时对应最大的漆酶活性即为该土壤的漆酶活性；(2)pH相近土壤的漆酶活性测定采用步骤B(1)⑥得到最适pH的B‑R缓冲液，根据步骤B(1)中步骤③～④测定该类pH相近的土壤样品的漆酶活性。