[发明专利]一种化学发光成像技术检测单核苷酸多态性的方法

摘要

本发明公开了一种化学发光成像技术检测单核苷酸多态性的方法，是通过以下步骤实现的：(1)连接酶扩增：准确加入G12C突变型k-ras基因与探针1、探针2、10×连接酶Ampligase反应缓冲液和TE缓冲液于离心管中，进行扩增；(2)将链霉亲和素磁性微球用HEPES缓冲溶液洗两次，加入上述离心管中，室温振荡孵育，磁分离后，弃去上清液，用HEPES缓冲液清洗；(3)上述离心管分别加入HEPES缓冲溶液和氯化血红素，室温振荡反应，得到磁性微球-DNA复合物；(4)将磁性微球-DNA复合物用HEPES缓冲溶液清洗，磁分离后，各加入鲁米诺、H₂O₂于全白96孔板中，采用美国UVP公司的化学发光成像分析仪测定其化学发光图像及发光强度；实现了对单核苷酸多态性的高灵敏、高选择性检测。

主权项

一种化学发光成像技术检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于，是通过以下步骤实现的：(1)连接酶扩增：准确加入含有待测基因的DNA样品与1μM的探针1、探针2各2μl、1μl10×连接酶Ampligase反应缓冲液和2μl TE缓冲液于离心管中，将上述离心管放入基因扩增仪，于95℃反应3min后，75℃下加入1μl连接酶Ampligase，酶活为5U于各个离心管中，设定基因扩增仪程序，使其在95℃1min和50℃1min循环反应30圈；反应结束后，产物于4℃继续反应10min，其中探针1的序列为5'‑GTGGCGTAGGCAAGAGT‑3'，5'端磷酸化，3'端生物素修饰，如SEQ ID NO.1所示，探针2的序列为5'‑GGGTAGGGCGGGTTGGGGTGGTAGTTGGAGCTT‑3'，如SEQ ID NO.2所示；(2)将链霉亲和素磁性微球用HEPES缓冲溶液洗两次，各取20μl加入上述离心管中，室温振荡孵育30min，磁分离后，弃去上清液，用HEPES缓冲液清洗三次；(3)上述离心管分别加入10μl HEPES缓冲溶液和10μl5×10^‑7M的氯化血红素，室温振荡反应20min，得到磁性微球‑DNA复合物；(4)将所得到的磁性微球‑DNA复合物用HEPES缓冲溶液清洗两次，磁分离后，各加入0.02M鲁米诺、0.2M H₂O₂各20μl于全白96孔板中，采用化学发光成像分析仪测定其化学发光图像及发光强度，来检测单核苷酸多态性；当发光强度大于30000时，待测样品即为突变型；当发光强度小于30000时，待测样品即为野生型。