[发明专利]一种利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇的方法

摘要

一种利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇的方法，它涉及一种制备正丁醇的方法。本发明要解决现有生物发酵生产正丁醇过程中底物成本高，木质纤维素水解过程中商品酶的应用造成成本上升，以及单一菌种纤维素酶系比例失衡造成的酶活降低等问题。方法：将预处理木质纤维素应用源于绿色木霉和黑曲霉纤维素酶混合粗酶液进行生物酶法水解，得到的糖液加入氮源、无机盐和维生素后通入氮气除氧，接种丙酮丁醇梭菌种子液进行厌氧发酵生产正丁醇。本发明提高了纤维素酶解过程中生物酶的活性，降低了生物发酵生产正丁醇过程中底物和酶法水解的成本消耗，减少了设备损耗和环境污染问题；本发明中混合粗酶液糖化水解效率达到75％。

主权项

一种利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇的方法，其特征在于，它是按以下步骤实现：一、对木质纤维素采用碱预处理：木质纤维素与质量百分含量为2％的氢氧化钠溶液按质量比为1:9的比例混合，得混合溶液，将混合溶液在100℃条件下处理2h，然后将混合溶液经蒸馏水洗涤至pH为中性并在105℃条件下烘干至恒重，得到的残余固体即为预处理的木质纤维素；二、混合粗酶液的获得：将绿色木霉和黑曲霉分别在好氧条件下采用液体发酵的方法获得绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液；然后将绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液按体积比为(2～4):1的比例混合，得到混合纤维素酶粗酶液；其中，液体发酵的具体操作如下：分别绿色木霉孢子和黑曲霉孢子接种到绿色木霉的液体产酶培养基和黑曲霉的液体产酶培养基中，然后在好氧发酵温度为28～32℃、转速为80～120r/min的条件下振荡培养4～6d，发酵过程结束后发酵液分别以5000g离心15min，分别收集上清液，所得上清液分别为绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液；三、将步骤一得到的预处理的木质纤维素按质量体积比为0.8～1.5g:10mL的比例加入到步骤二得到的混合纤维素酶粗酶液中，在水解体系pH值4.0～5.5、温度为50～60℃的条件下对预处理的木质纤维素进行酶水解48～60h，然后经5000g离心15min，取上清液后浓缩，再加入厌氧培养基中并通入氮气除氧，再接入丙酮丁醇梭菌种子液进行厌氧发酵96h，即完成利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇；其中，步骤二中所述的所述绿色木霉的孢子接种量为10⁸～10⁹个/L，所述的绿色木霉的液体产酶培养基含有浓度为2.0g/L的KH₂PO₄溶液、浓度为1.4g/L的(NH₄)₂SO₄溶液、浓度为0.3g/L的MgSO₄·7H₂O溶液、浓度为0.3g/L的CaCl₂溶液、浓度为0.3g/L的尿素溶液、浓度为20g/L的麸皮溶液、浓度为8g/L的玉米秸秆溶液、浓度为5g/L的豆饼粉溶液以及微量金属元素贮液1mL/L；所述的微量金属元素贮液母液含有浓度为5.0g/L的FeSO₄·7H₂O溶液、浓度为1.6g/L的MgSO₄溶液、浓度为1.4g/L的ZnSO₄·7H₂O溶液以及浓度为2.0g/L的CoCl₂溶液；步骤二中所述的黑曲霉的孢子接种量为10¹²～10¹⁶个/L；所述的黑曲霉的液体产酶培养基含有浓度为1.0g/L的麸皮溶液、浓度为1.4g/L的(NH₄)₂SO₄溶液、浓度为2.0g/L的KH₂PO₄溶液、浓度为0.3g/L的CaCl₂溶液、浓度为0.3g/L的MgSO₄溶液、浓度为1.6mg/L的FeSO₄·7H₂O溶液、浓度为1.4mg/L的ZnSO₄·7H₂O溶液和浓度为2.0mg/L的CoCl₂溶液；步骤三中所述的厌氧培养基中含有浓度为2.0g/L的酵母粉溶液、浓度为2.5g/L的KH₂PO₄溶液、浓度为3.0g/L的Na₂HPO₄溶液、浓度为1.0g/L的NH₄Cl溶液、浓度为0.4g/L的MgSO₄溶液、浓度为0.5g/L的半胱氨酸溶液、维生素储液lmL/L、微量金属元素储液1mL/L以及浓度为0.05g/L的刃天青溶液；所述维生素贮液每1L是由50.0mg的硫辛酸、20.0mg的生物素、0.35g的烟酸、5.0mg的盐酸硫胺素、50.0mg的对氨基苯甲酸、20.0mg的叶酸、50.0mg的泛酸钙、1.0mg的维生素B₁₂和100.0mg的盐酸吡哆醇组成；所述微量金属元素储液每1L由1.5g的FeCl₂、70mg的ZnCl₂、6mg的硼酸0.1g的MnCl₂·4H₂O、2mg的CuCl₂·2H₂O、0.19g的CoCl₂·6H₂O、24mg的NiCl₂·6H₂O、36mg的Na₂MO₄·H₂O、15mg的Na₂WO₄·2H₂O和15mg的Na₂SeO₄·5H₂O组成；步骤三中所述的丙酮丁醇梭菌，其种子液接种量是按体积百分含量为2％的生长至对数期、600nm条件下OD值为1.0的液体悬浊液。