[发明专利]一种植物基因启动子克隆方法

摘要

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种植物基因启动子克隆方法。本发明所提供的植物基因启动子克隆方法，主要包括基因和接头引物的设计，植物基因组DNA的限制性酶切，接头的制备，接头的连接及产物的PCR扩增。与目前常用的启动子克隆方法相比，该方法具有方便、高效，成本低等优点，本发明所述植物基因启动子克隆方法适用于所有植物。

主权项

一种植物基因启动子克隆方法，其特征由以下步骤构成：(1)使用一种在目的基因内部没有切点的限制性内切酶降解植物基因组DNA；(2)设计两条接头序列，分别为5’‑GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT‑3’与5’‑PO₄‑ACCAGCCC‑NH₂‑3’，将两条序列退火制备成接头；(3)将接头与酶解后的基因组片段进行连接，制备成两段带有接头的DNA片段；(4)从靠近目的基因5’端的地方反向设计一条引物，同时根据长接头序列进行另一条引物设计；(5)使用一种热启动DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增反应采用两步法，PCR反应条件采用温度梯度退火反应法。第一步反应程序为：94℃5分钟；94℃2秒，72℃3分钟，2个循环；94℃2秒，70℃3分钟，2个循环；94℃2秒，68℃3分钟，2个循环；94℃2秒，66℃3分钟，32个循环；66℃10分钟；第二步反应程序为：94℃5分钟；94℃2秒，72℃3分钟，2个循环；94℃2秒，70℃3分钟，2个循环；94℃2秒，68℃3分钟，2个循环；94℃2秒，66℃3分钟，20个循环；66℃10分钟；(6)取10μL反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用DNA分子量标准作为对照，将凝胶在紫外灯下观察、拍照，根据特异性条带的分子量大小判断所克隆的启动子片段的长度。