[发明专利]一种用斑马鱼对药物功效的评价方法

摘要

本发明公开了一种为斑马鱼应用于中药安全性评价和鱼类生理学的研究提供基础资料的药物功效评价方法，包括如下步骤，1)、试验材料的准备：a）、药品，b）、实验仪器，c）、实验鱼驯养；2)、试验方法：a）、设置浓度梯度，b）、排除消化过程差异，c）、药物处理，d）、实验鱼恢复平静，e）、记录窒息时间的准备，f）、记录窒息时间，g）、实验鱼的乳酸的测定，h）、计算实验鱼体内乳酸的含量，i）、实验鱼的乳酸脱氢酶的测定，j）、统计分析。通过本发明，证明斑马鱼应用于中药药物筛选安全性评价是可行的，本研究可为斑马鱼应用于中药安全性评价和鱼类生理学的研究提供基础资料。

主权项

一种用斑马鱼对药物功效的评价方法，其特征在于，包括如下步骤：1）、试验材料的准备：a）、  药品：由三普药业股份有限公司销售三普红景天胶囊；由南京建成生物工程研究所销售的乳酸测定试剂盒、乳酸脱氢酶试剂盒；b）、  实验仪器：可见光分光光度计，酶标仪；c）、  实验用鱼驯养：以购自广东的斑马鱼作为实验鱼，首先进行为期4周的驯养实验，以小型颗粒饲料为饵料，培养在水温25℃，溶氧大于6.5mg/L，光制为12：12的环境中；2）、试验方法：a）、设置浓度梯度，设置6个处理实验的红景天浓度梯度各为0 mg/L、0.01mg/L、0.02mg/L、0.04mg/L、0.08mg/L和0.16mg/L，各处理实验的实验鱼数量为20条；b）、排除消化过程差异，实验前，斑马鱼禁食24h以排除消化过程差异，然后随机选取实验鱼分配到各处理组；c）、药物处理，红景天水溶液置于1L玻璃烧杯中，然后于恒温25℃水浴控制温度，采用小型气泵充氧，往水体中放入实验鱼后立即以塑料筛网罩住烧杯杯口；d）、实验鱼恢复平静，药物处理结束后，小心移出斑马鱼，移出后的斑马鱼逐个放入预先注入恒温养殖水的25mL小口玻璃瓶中，充满水后，用塑料筛网罩住玻璃瓶口，放入恒温水浴，适应10min，使实验鱼恢复平静；e）、记录窒息时间的准备，用小塑料管向玻璃瓶内注入饱和溶氧养殖用水，10s内使瓶内的水全部被换出后，盖紧橡胶塞，并以秒表开始计时；f）、记录窒息时间，直至实验鱼身体失去平衡发生侧翻时，记录时间，为窒息时间；为消除个体大小对实验结果的影响，对体重差异进行了以下校正：ts=ti*(m/0.2)0.75*25/(25‑m)，其中ts为校正后时间，ti为校正前时间，m为体重；将各浓度梯度试验校正后的时间ts与对应浓度关系制作成标准曲线；g）、实验鱼的乳酸的测定，把用于测定缺氧窒息的实验鱼在实验结束后，在低于4摄氏度的环境中制成生理盐水匀浆液，再将此生理盐水匀浆液稀释10倍后离心取上清液，再将此上清液稀释5倍，再用乳酸测试盒按步骤加样，最后在530nm波长时用可见光分光光度计测其吸光值，并制作计算乳酸含量的标准曲线；h）、计算实验鱼体内乳酸的含量，采用以下方法计算实验鱼体内乳酸的含量：组织中乳酸的含量=c*50/1000其中，c为通过乳酸含量的标准曲线计算得出的匀浆稀释液乳酸浓度，计算后绘制出各浓度试验的乳酸含量标准曲线图；i）、实验鱼的乳酸脱氢酶的测定，上步操作制得的斑马鱼生理盐水匀浆液，离心取上清液，稀释20倍，用乳酸脱氢酶测定试剂盒按步骤加样，反应15min，用酶标仪在450nm波长时测其吸光度；并通过换算出每个浓度试验中乳酸脱氢酶的浓度，制作各个浓度试验中乳酸脱氢酶浓度的标准曲线；j）、统计分析，采用单因素方差分析及多重比较分析不同浓度处理造成的差异。