[发明专利]一种去除PCV2病毒中支原体污染的方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种去除PCV2病毒中支原体污染的方法。该种去除PCV2病毒中支原体污染的方法包括步骤：0.1μm滤菌器过滤PCV2病毒并繁殖四代，PCV2病毒用终浓度2.5μg/ml的Plasmocin处理两代，常规繁殖PCV2两代。本发明采用先过滤再用抗生素的方法，不仅节省了实验成本，更为重要的是抗生素使用次数少，浓度小，去除支原体时间短，整个处理过程仅需8代，约16～20天可完成，且不会使PCV2病毒效价降低，可为疫苗生产提供无支原体且病毒效价高的PCV2病毒，并为单位体积内疫苗半成品病毒含量的提高提供了保障。

主权项

一种去除PCV2病毒中支原体污染的方法，其特征在于，具体步骤包括：(1)0.1μm滤菌器过滤PCV2病毒并繁殖四代；(2)PCV2病毒用终浓度2.5μg/ml的Plasmocin处理两代；(3)常规繁殖PCV2两代；所述步骤(1)具体包括下述步骤：A、用含5％胎牛血清(PAA，A10209‑1611)的MEM培养基(GIBCO，574131)培养PK‑15细胞，细胞密度为2×10⁵个/ml，将PCV2病毒用0.1μm滤菌器过滤后，向MEM培养基中接种PCV2病毒，使PCV2病毒接种量为MEM培养基体积的1％，然后将装有接种PCV2病毒的MEM培养基的细胞瓶，置于温度为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中，培养72h；B、将步骤A培养后的细胞瓶，进行冻融操作：将细胞瓶置于温度为‑70℃的冰箱中冷冻12h，然后再取出细胞瓶置于常温(15～25℃)中融化；C、再将细胞瓶进行步骤B的冻融操作两次，即共反复三次冻融操作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液；D、将步骤A中的PCV2病毒替换成步骤C中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，再依次重复步骤A、步骤B、步骤C的处理3次，即制得PCV2病毒；所述步骤(2)具体包括下述步骤：E、用含5％胎牛血清的MEM培养基培养PK‑15细胞，细胞密度2×10⁵个/ml，再向MEM培养基中接种步骤(1)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接种量为MEM培养基体积的1％，并向MEM培养基中加入Plasmocin(Invivogen，MPT‑34‑01B)，使Plasmocin的终浓度为2.5μg/ml，然后将装有接种了PCV2病毒的MEM培养基的细胞瓶，置于温度为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中，培养72～96h；细胞铺满后，将细胞瓶反复进行3次步骤B中的冻融操作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液；F、将步骤E中的PCV2病毒替换成步骤E中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，重复一次步骤E的操作，繁殖一代PCV2病毒；所述步骤(3)具体包括下述步骤：G、用含5％胎牛血清的MEM培养基培养PK‑15细胞，细胞密度2×10⁵个/ml，再向MEM培养基中接种步骤(2)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接种量为MEM培养基体积的1％，然后将装有接种了PCV2病毒的MEM培养基的细胞瓶，置于温度为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中，培养72h；将培养后的细胞瓶取出后，反复进行3次步骤B中的冻融操作，得到细胞瓶中冻融好的PCV2病毒悬液；H、将步骤G中的PCV2病毒替换成步骤G中得到的冻融好的PCV2病毒悬液，重复一次步骤G的操作，继续繁殖一代PCV2病毒，即制得所需的PCV2病毒。