[发明专利]一种四溴双酚A的间接竞争酶联免疫检测方法

摘要

一种四溴双酚A的间接竞争酶联免疫检测方法，包括1)用四溴双酚A合成人工抗原；2)制备四溴双酚A多克隆抗体：以四溴双酚A与BSA的偶联物为免疫抗原，免疫昆明大白鼠并利用现有的多克隆抗体制备与纯化技术获得四溴双酚A多克隆抗体；3)间接竞争ELISA检测：选择包被抗原浓度为10μg/mL，并用碳酸盐缓冲液稀释；洗板，加入缓冲液封闭，再次洗板；进行竞争，洗板，加二抗，洗板；进行显色反应；最后酶标仪测定450nm的吸光值(OD₄₅₀)。本发明建立了四溴双酚A的间接竞争ELISA方法，为环境中四溴双酚A残留检测提供了一种快速高效的检测手段。由于该方法采用的是多克隆抗体，成本较低且准确性和稳定性较好。

主权项

一种四溴双酚A的间接竞争酶联免疫检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)用四溴双酚A合成人工抗原的步骤：即首先将四溴双酚A衍生化制成半抗原，再将所述的半抗原与BSA制备成偶联物作为免疫抗原；然后将所述的四溴双酚A半抗原与OVA制备成偶联物，并将该偶联物作为包被抗原。2)四溴双酚A多克隆抗体的制备步骤：以四溴双酚A与BSA的偶联物为免疫抗原，免疫昆明大白鼠并利用现有的多克隆抗体制备与纯化技术获得四溴双酚A多克隆抗体，该抗体可与四溴双酚A特异性结合；3)间接竞争ELISA检测步骤：利用棋盘滴定法对包被抗原和抗体工作浓度进行筛选，选择包被抗原浓度为10μg/mL，多克隆抗体稀释度为1:2400，酶标二抗(辣根过氧物酶标记的兔抗大鼠IgG(RAM‑HRP))稀释度为1:4000；以0.05M的碳酸盐缓冲液稀释步骤1得到的包被抗原至10μg/mL，将稀释后的包被抗原加入酶标板中，每孔100μL，置于4℃冰箱内孵育过夜；将孵育过夜后的酶标板甩干液体，然后加入200μL/孔洗涤液洗涤3次后，加入封闭液，所述的封闭液是含1％酪蛋白的上述0.05M的碳酸盐缓冲液，37℃封闭2h；用PBST将四溴双酚A标准品溶液及待测样品稀释后，分别加入到各自的酶标孔中，每孔加100μL；同时分别以抗体稀释液(所述的抗体稀释液是含1％酪蛋白的PBST溶液)以1:2400的比例稀释步骤2得到的多克隆抗体，再加入酶标板中，每孔100μL；37℃孵育30‑60min后以PBST洗涤3次；以抗体稀释液1:4000的比例稀释辣根过氧物酶标记的兔抗大鼠IgG(RAM‑HRP)，然后加入酶标板中，每孔100μL，37℃孵育30‑60min后以PBST洗涤3次；将四甲基联苯胺显色液A液和B液1:1混合后加入酶标板中，每孔100μL，37℃显色20min；将加入2M硫酸溶液加入酶标板中终止反应，每孔50μL；用酶标仪在450nm波长下测吸光值OD₄₅₀，得到四溴双酚A标准品溶液的标准曲线，以及待测样品的吸光值，将所得的待测样品的吸光值与所做标准曲线对比可比算出待测样品的四溴双酚A含量。