[发明专利]肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，步骤如下：取保藏号为CGMCC No.2279的肠杆菌Z0206；接种到灭菌PDA加富固体培养基上，得到活化菌种；将活化菌种接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵，得到发酵种子液；接种发酵种子液，得到含有肠杆菌Z0206胞外多糖的发酵液；加入乙醇，分离取沉淀，得到粗多糖粉末；将粗多糖粉末溶解于20倍体积热的蒸馏水中，加入胰蛋白酶和木瓜蛋白酶；将所得的蛋白酶处理液取上清；向所得的清液中加Sevag试剂，制得多糖溶液；将所得的多糖溶液，经真空冷冻干燥等步骤后，得多糖精品。

主权项

一种肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，其特征是:(1)斜面种子培养：取保藏号为CGMCC No.2279的肠杆菌Z0206；种肠杆菌Z0206多糖的制备方法：接种到灭菌PDA加富固体培养基上，28‑32℃培养36‑48h，再次转接到PDA加富固体培养基上，28‑32℃培养36‑48h，得到活化菌种；(2)发酵罐培养：将步骤(1)所得到的活化菌种接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵，温度28‑32℃摇床振荡培养18‑20h，得到发酵种子液；发酵罐内加入70％发酵培养基，121℃蒸汽灭菌20min，接种发酵种子液，发酵时间48‑72h，得到含有肠杆菌Z0206胞外多糖的发酵液；(3)将步骤(2)所得的发酵液于60‑70℃条件下，旋转蒸发浓缩为原体积的1/10，加入3‑5倍体积预冷的95％乙醇，分离取沉淀，依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤，真空干燥，得到粗多糖粉末；(4)将步骤(3)所得的粗多糖粉末溶解于20倍体积热的蒸馏水中，用Na₂CO₃调pH至7.0‑9.0，加入质量为多糖质量1/40‑1/20的胰蛋白酶，55℃水解1‑2h后，用草酸调pH至5.0‑5.7，加质量为多糖质量1/40‑1/20的木瓜蛋白酶，65‑70℃水解2‑3h后，于100℃水浴加热5‑6min，以终止酶反应；(5)将步骤(4)所得的蛋白酶处理液用草酸调pH值至7.0，加入3％的三氯乙酸，室温下180‑200r/min搅拌1h后，11000rpm离心10‑15min，取上清；(6)向步骤(5)所得的清液中加入1/3体积的Sevag试剂，充分振荡脱去蛋白，制得多糖溶液；(7)将步骤(6)所得的多糖溶液用氨水调pH至8.0，在50℃下滴加20％的H₂O₂，至溶液为淡黄色，保温2h，然后用稀盐酸中和PH值至7.0；自来水透析1‑2d，蒸馏水透析2‑3d后，经真空冷冻干燥得多糖精品。