[发明专利]甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis的定向分离及鉴定方法

摘要

本发明涉及一种甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilumoxytropis的定向分离及鉴定方法。从甘肃棘豆中分离内生真菌Undifilumoxytropis时，不可避免的会分理出其他种属的菌株，影响分离效率。本发明用蒸馏水、乙醇、无菌水和次氯酸钠依次清洗甘肃棘豆的茎和成熟种子，再将组织剪成小块置于PDA平板上，平板中充满CO₂并用保鲜膜密封，光照下室温培养，待切口处长出菌丝后，挑取顶端菌丝转接至培养基上纯化，刮取菌丝，随后将菌株接种至试管斜面冷藏；提取分离菌株的基因组DNA，在GeneBank中进行序列比对。本发明从疯草中只分离得到一种菌，减少其他种属内生真菌的干扰，方法简便易行，保存过程中菌株不易发生变异或菌株活性减低。

主权项

甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis的定向分离及鉴定方法，其特征在于：由以下步骤实现：步骤一：分离：将甘肃棘豆的茎和成熟种子用蒸馏水冲洗干净，经质量分数为75%的乙醇溶液漂洗30 s、无菌水冲洗3次、有效氯的质量百分含量为2%的次氯酸钠溶液漂洗3 min、无菌水冲洗3‑5次后，再将组织剪成5mm×5mm小块，分别置于PDA平板上，平板中充满CO₂并用保鲜膜密封，在光照条件下于室温培养，待切口处长出菌丝后，挑取顶端菌丝转接至PDA培养基上纯化2‑3次，刮取菌丝，随后将菌株接种至试管斜面，4℃冰箱保存备用；步骤二：ITS序列比对：（1）刮取新鲜菌丝80mg，用去离子水冲洗干净后，再用无菌水冲洗一次，用滤纸将菌丝表面水吸干后放入1.5mL离心管内，加入液氮迅速研磨至粉末；（2）向管内加入预热65℃的2×CTAB缓冲液500μL，振荡混匀，置于65℃水浴锅中温育30min，中间摇晃2‑3次；（3）放置至室温后，加入500μL的萃取混合液，振荡混匀后，室温静置5min，期间持续轻摇；（4）4℃，12000 r/min，离心15min；（5）吸取上清，再加入500μL的CTAB提取液，混匀，于65℃再温育15min；（6）加入500μL的萃取混合液，振荡混匀，12000 r/min，4℃离心15min；（7）取上清加入1/10体积、pH5.2、摩尔体积浓度为3mol/L 的NaAC，再加入500μL的异戊醇，轻摇即出现沉淀，‑20℃放置30min以上；4℃，13000 r/min，离心15min；弃上清，用质量分数为75%的冷乙醇溶液100μL洗涤沉淀两次，室温下风干；（8）用pH8.0的TE缓冲液或灭菌的双蒸水溶解，于4℃贮存；以真菌rDNA扩增的通用引物ITS1（5’‑TCCGTAGGTGAACCTGCGC‑3’）和ITS4（5’‑TCCTCCGCTTATTGATA TGC‑3’）为上、下游引物，扩增其核糖体rDNA‑ITS保守序列；进行扩增的PCR反应体系为50μL：TaKaRa Taq DNA聚合酶2.5U、10×PCR Buffer 5μL、MgCl₂ 3ΜL、Dntp 4μL、ITS1和 ITS4引物各2μL、模板DNA 0.5μL，加双蒸水至50μL；反应条件为：95℃预变性5min；（9）95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min使其完全反应；（10）将PCR产物加入质量体积分数为15g/L的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统中进行分析，真菌5.8S rDNA‑ITS序列的长度一般为500‑700bp，对扩增产物进行测序，将测定的5.8S rDNA‑ITS序列用BLAST与GenBank中的5.8S rDNA‑ITS序列进行同源性比较，应用Clustal X 1.83 version 和MEGA 5.0 软件，分别采用邻接法和最大简约法构建系统进化树进行种属归类，自展法检测进化树，自展数据集为1000次。