[发明专利]肠杆菌Z0206细菌富硒多糖的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法，包括以下步骤：挑取肠杆菌Z0206耐硒菌株，涂布于含硒的PDA加富培养基上进行驯化；通过测定细菌的生长曲线，确定最佳加硒时间和培养时间；将耐硒驯化后的肠杆菌Z0206菌种，接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵；得到含有肠杆菌Z0206富硒多糖的发酵液；将发酵液中收集上清液，再制备得到富硒粗多糖粉末；将所得的富硒粗多糖粉末溶解于20倍体积的热蒸馏水中，加入胰蛋白酶和木瓜蛋白酶；取所得的蛋白酶处理液，用草酸调pH值至7.0等处理后，取上清；向所得的上清液中加入Sevag试剂，得到脱蛋白富硒多糖；将所得到的脱蛋白富硒多糖配成0.5％的多糖溶液制备获得富硒多糖精品。

主权项

一种肠杆菌Z0206富硒多糖的制备方法，其特征包括以下步骤：(1)肠杆菌Z0206耐硒菌株驯化：挑取肠杆菌Z0206耐硒菌株，先后涂布于含硒量分别为10、20、30、40以及50μg/mL的PDA加富培养基上，进行硒浓度梯度驯化；每个梯度于28‑32℃培养24‑36h；最后从含硒量50μg/mL的PDA加富培养基平板上挑取生长良好的菌落于平板上划线分离，纯化后斜面保存；(2)肠杆菌Z0206富硒研究：通过测定细菌的生长曲线，确定最佳加硒时间和培养时间；从斜面上挑取驯化好的菌种，PDA培养基平板活化培养24‑36h后，接种于装有PDA液体培养基的三角瓶中；28‑32℃振荡培养，每隔1h无菌操作取出1mL培养液，用分光光度计测定580nm下的吸光值；绘制耐硒菌的生长曲线；通过生长曲线确定加硒时间及培养时间；从斜面上挑取已经驯化好的耐硒菌种，接种于含硒量分别为10、15、20、25、30以及35μg/mL的PDA加富培养基上，28‑32℃培养24‑48h，选取培养基上菌体颜色略红、生长良好的硒浓度作为最佳硒浓度；(3)发酵液获取：将耐硒驯化后的肠杆菌Z0206菌种，接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵，28‑32℃往复振荡培养，培养时间18‑19h，得到发酵罐发酵种子液；发酵罐内加入70％发酵培养基，121℃蒸汽灭菌20min后，接种种子液，培养13h时加入无菌亚硒酸钠溶液，使培养基最终含硒量为25μg/mL，发酵时间48‑72h，得到含有肠杆菌Z0206富硒多糖的发酵液；(4)多糖粉末获取：将步骤(3)所得的发酵液于60‑70℃浓缩为原体积的1/10,80‑90℃水浴1‑1.5h，5000rpm离心10‑15min，收集上清液，加入3‑5倍体积的预冷95％乙醇，静置12h，5000rpm离心10‑15min，沉淀依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤2‑3次，离心，沉淀真空干燥，得到富硒粗多糖粉末；(5)蛋白酶处理：将步骤(4)所得的富硒粗多糖粉末溶解于20倍体积的热蒸馏水中，用Na₂CO₃调pH至7.0‑9.0，加入质量为多糖质量1/40‑1/20的胰蛋白酶，55℃水解1‑2h后，用草酸调pH值至5.0‑5.7，加质量为多糖质量1/40‑1/20的木瓜蛋白酶，65‑70℃水解2‑3h后，于100℃水浴加热5‑6min，以终止酶反应；(6)三氯乙酸法脱蛋白：取步骤(5)所得的蛋白酶处理液，用草酸调pH值至7.0，加入3％的三氯乙酸，室温下磁力搅拌1h后，11000rpm离心10‑15min，取上清；(7)Sevag法脱蛋白：向步骤(6)所得的上清液中加入1/3体积的Sevag试剂，充分振荡，混合20‑30min，充分静置分层，4000rpm离心5min，重复操作数次至两相界面不再出现蛋白沉淀；然后用3‑5倍体积预冷的95％乙醇醇析，所得的沉淀再依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤后，沉淀真空干燥，得到脱蛋白富硒多糖；(8)脱色：将步骤(7)所得到的脱蛋白富硒多糖配成0.5％的多糖溶液，用氨水调pH至8.0，在50℃下滴加20％的H₂O₂，至溶液为淡黄色，保温2h，然后用稀盐酸中和至7.0；自来水透析2‑3d，蒸馏水透析2‑3d后，加入3‑5倍体积的预冷95％乙醇沉淀，4℃静置12h后，500rpm离心10～15min，沉淀真空干燥，得富硒多糖精品。