[发明专利]一种快速鉴定鸭圆环病毒基因型的双重PCR方法

摘要

本发明提供了一种快速鉴定鸭圆环病毒基因型的双重PCR方法，通过对参考GenBank上已发表的DuCV-1和DuCV-2的序列进行比对，选择在DuCV-1和DuCV-2的保守区分别设计一对针对DuCV的通用特异性引物SEQ1/SEQ2，1型鸭圆环病毒特异性引物SEQ3和2型鸭圆环病毒特异性引物SEQ4；本发明主要是设计并筛选了新的特异性引物，优化了反应过程中的各种参数，利用本组引物建立的针对鸭圆环病毒的双重PCR分型方法特异性强、敏感性更高，可以快速准确地进行DuCV-1和DuCV-2的鉴定。

主权项

一种快速鉴定鸭圆环病毒基因型的双重PCR特异性引物，其特征在于是通过对参考GenBank上已发表的DuCV‑1和DuCV‑2的序列进行比对，选择在DuCV‑1和DuCV‑2的保守区分别设计一对针对DuCV的通用特异性引物SEQ1/SEQ2，1型鸭圆环病毒特异性引物SEQ3和2型鸭圆环病毒特异性引物SEQ4：SEQ1：5’‑CGG GAA ATG ACG TAG TCG TCA TG‑3’，SEQ2：5’‑GG(A/C)(C/T)T(G/A)AAC ATG AGA TGG GC‑3’，SEQ3：5’‑GTT CAC TCC(G/T)GT TGT GTT GTC(C/T)GG‑3’，SEQ4：5’‑GAT AAT GCG AC(C/T)GGC GAC G‑3’；所有引物以无菌ddH₂O(Rnase free)配成25pmol/μL的浓度备用；上述引物的使用方法如下：A、常规方法提取待测鸭各个脏器组织DNA作为模板，进行PCR反应；反应体系为：1μL组织DNA、1×PCR buffer：50mM KCl,10mM Tris‑HCl，pH8.3、1.5mM MgCl₂、0.2mM dNTPs、1U Taq DNA Polymerase、引物SEQ1、SEQ2、SEQ3和SEQ4各1μL，加水补齐至25μL；PCR扩增程序为：94℃5min；94℃45s，68℃90s，共35个循环；最后72℃延伸10min；B、对步骤A得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：如果从样品中扩增出了1032bp和446bp的产物，则该样品为DuCV‑1阳性，DuCV‑2阴性；如果从样品中扩增出了1032bp和599bp的产物，则该样品为DuCV‑2阳性，DuCV‑1阴性；如果同时扩增出了1032bp、446bp和599bp的产物，则该样品为DuCV‑1和DuCV‑2亚型同时存在；如果未扩增出了1032bp、446bp和599bp的产物，则该样品不含有DuCV‑1和DuCV‑2。