[发明专利]表达增强型绿色荧光蛋白基因的鸭瘟病毒重组疫苗株及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的鸭瘟病毒重组疫苗株及其构建方法和应用。具体地，本发明利用重组克隆技术，将包含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CMV启动子序列的基因片段CMV‑EGFP替换鸭瘟病毒的US10基因，构建获得缺失US10基因并在其相应位置插入CMV‑EGFP表达盒的重组EGFP鸭瘟病毒，该重组病毒能够稳定表达EGFP基因。本发明的一种鸭瘟病毒重组疫苗株，命名为rDEVUS10‑EGFP，微生物保藏号是CGMCC No.8660。本发明还涉及构建稳定表达其他禽类病原外源基因的重组鸭瘟病毒疫苗株的方法，以及重组鸭瘟病毒疫苗株在制备预防鸭瘟和其他禽类传染病的疫苗中的应用。

主权项

一种构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的鸭瘟重组病毒株的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)构建包含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CMV启动子序列的基因片段CMV‑EGFP的重组转移载体，其中在所述基因片段CMV‑EGFP上下游分别连有扩增得到的位于鸭瘟病毒US10基因两侧的侧翼序列，所述的包含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CMV启动子序列的基因片段CMV‑EGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；其中用于扩增位于鸭瘟病毒US10基因两侧的侧翼序列的引物如下所示：VL1上游:5’‑ATCGATTGACGATGAGCGATCGGAAT‑3’VL2下游:5’‑CCTAGGGTTGCGCGTTGTGTATAAGT‑3’VR1上游:5’‑ACGCGTGACTCTGACTGATACTCTAC‑3’VR2下游:5’‑ATGCATCTAATCGGTTATTTGCTGCT‑3’；(2)提取鸭瘟病毒的完整基因组DNA；(3)利用步骤(1)中获得的重组转移载体与步骤(2)中获得的鸭瘟病毒的完整基因组DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞，通过荧光显微镜筛选表达绿色荧光蛋白的病毒，再经过病毒蚀斑纯化，获得单一的稳定表达EGFP的鸭瘟重组病毒株。