[发明专利]含人类骨保护素基因的重组慢病毒载体及其制备方法和应用在审
| 申请号： | 201410331750.7 | 申请日： | 2014-07-11 |
| 公开（公告）号： | CN104651386A | 公开（公告）日： | 2015-05-27 |
| 发明（设计）人： | 苏方;刘洪臣 | 申请（专利权）人： | 中国人民解放军总医院;中国人民解放军第306医院 |
| 主分类号： | C12N15/66 | 分类号： | C12N15/66;C12N15/867;C12N7/01;C12N5/10;A61L27/38;A61L27/12;A61L27/54 |
| 代理公司： | 北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙) 11201 | 代理人： | 李志东 |
| 地址： | 100853*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | 本发明公开了含有人类骨保护素基因的重组慢病毒载体及其制备方法和应用，制备方法如下：将人类骨保护素基因编码序列区域克隆连接到T载体上；扩增两端含有酶切位点的人类骨保护素基因的编码序列片段连接到pIRES-EGFP载体上，获得OPG-IRES-EGFP载体；扩增出OPG-IRES-EGFP序列，亚克隆到载体pcDNA6.2w上；将pcDNA6.2w上的OPG-IRES-EGFP序列经BP重组到入门载体上，再经LR重组到pLenti6.3/V5载体上，得到Lenti6.3-hOPG-IRES-EGFP。该载体能够实现转染基因在体内持续、稳定的表达，并能用于极难转染的干细胞和原代细胞。 | ||
| 搜索关键词： | 人类 保护 基因 重组 病毒 载体 及其 制备 方法 应用 | ||
【主权项】：
一种制备含有人类骨保护素基因重组慢病毒载体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)合成人类骨保护素基因的编码序列区域；(2)将人类骨保护素基因的编码序列区域克隆连接到T载体上；(3)使用第一引物从连接骨保护素的T载体扩增两端含有酶切位点的人类骨保护素基因的编码序列片段；(4)将步骤(3)得到的基因片段连接到pIRES‑EGFP载体上，获得OPG‑IRES‑EGFP载体；(5)将步骤(4)制备的OPG‑IRES‑EGFP重组载体转化大肠杆菌，筛选阳性克隆；(6)使用第二引物从阳性克隆扩增出OPG‑IRES‑EGFP序列，亚克隆到载体pcDNA6.2w上；(7)将步骤(6)制备的重组载体上的所述OPG‑IRES‑EGFP序列经BP重组反应到入门载体上，再经LR重组反应到pLenti6.3/V5载体上，得到pLenti6.3‑hOPG‑IRES‑EGFP重组载体。
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