[发明专利]运动发酵单胞菌CRISPR-Cas9系统的构建与应用

摘要

构建CRISPR-Cas系统表达质粒pSUZM1a-Cas9，pSUZM2a-Cas9，pSUZM3a-Cas9，包含运动发酵单胞菌内源性基因启动子、筛选标记基因和CRISPR系统的Cas9基因。构建表达质粒pUC-T7sgRNA，含复制起点、筛选标记基因、T7基因启动子和终止子、BbsI识别序列和crRNA-tracrRNA序列。设计相应的靶序列，DNA模板经T7RNA聚合酶体外转录，经纯化后获得的sgRNA与Cas9基因表达质粒共电转化大肠杆菌和Z.mobilisZM4。结果表明，利用CRISPR技术能够成功敲除大肠杆菌DH5α的upp基因、有效地消除运动单胞菌中的天然质粒。在研究过程中所建立的Cas9基因表达质粒、sgRNA表达质粒以及成套研究方法可以广泛地用于运动发酵单胞菌基因组中基因的敲除，具有很好的市场应用前景。

主权项

一类能在运动发酵单胞菌中表达CRISPR‑Cas9系统的表达质粒pSUZM1a‑Cas9、pSUZM2a‑ Cas9和pSUZM3a‑ Cas9，包含运动发酵单胞菌内源性基因启动子、筛选标记基因和CRISPR系统的Cas9基因。