[发明专利]一种猪瘟病毒C株EST敏感细胞系的选育方法

摘要

本发明公开了一种猪瘟病毒C株EST敏感细胞系的选育方法，包括以下步骤：(1)EST细胞单克隆化：无外源微生物污染的EST细胞，以CSFV C株感染，37℃5％CO2条件下培养48h后，经0.25％胰蛋白酶消化成分散的单个细胞后进行连续4倍梯度稀释，种于96孔细胞板，37℃5％CO2条件下培养，8小时后观察每孔，排除存在细胞团的培养孔，然后继续培养1周，挑选由单一细胞克隆化生长的细胞孔，将孔中细胞进行亚克隆筛选，连续以此方法亚克隆筛选3次后获得亚克隆细胞系。本发明简化传统细胞苗生产过程中的单次接毒程序，为猪瘟细胞苗的生产缩短周期和降低成本。

主权项

一种猪瘟病毒C株EST敏感细胞系的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)EST细胞单克隆化无外源微生物污染的EST细胞，以CSFV C株感染，37℃5％CO2条件下培养48h后，经0.25％胰蛋白酶消化成分散的单个细胞后进行连续4倍梯度稀释，种于96孔细胞板，37℃5％CO2条件下培养，8小时后观察每孔，排除存在细胞团的培养孔，然后继续培养1周，挑选由单一细胞克隆化生长的细胞孔，将孔中细胞进行亚克隆筛选，连续以此方法亚克隆筛选3次后获得亚克隆细胞系；(2)可高滴度繁殖猪瘟病毒C株细胞系的选育及鉴定将上述EST细胞各克隆细胞系分别接种于24孔细胞培养板内，37℃5％CO2条件下培养48h，弃去培养液，用PBS洗细胞2次，经0.25％胰蛋白酶消化后收集细胞，利用RNAisoPlus试剂提取总RNA，经RT‑PCR后初步鉴定出持续感染有猪瘟病毒C株的细胞系；RT‑PCR鉴定CSFV C株的特异性引物：上游引物：TAACACGACTGTCAAGGTGC；下游引物：AACCATGAGCAATGCCACT；将初步鉴定持续带毒的EST细胞系于35mm的培养皿内，待细胞长满单层后，利用间接免疫荧光检测确定阳性细胞数，免疫荧光检测显示，几乎100％的细胞均带有CSFV抗原；将确定以高滴度猪瘟病毒C株持续感染的EST细胞系进行传代培养，分别在3，9，15代进行反复三次冻融收毒；病毒原液离心去除细胞碎片后，以DMEM液按10倍梯度稀释，将病毒稀释液接毒于铺满96孔板的PK15细胞，37℃，5％CO2培养箱培养48h后，用间接免疫荧光方法检测病毒感染细胞；按照Reed‑Muench方法计算病毒半数致死量TCID50，以3次重复实验结果的算术平均值为培养病毒的感染滴度；TCID50测定结果显示，细胞连续传代15代以上，其病毒低度维持在105.5TCID50/mL，比单次接种EST母细胞后的病毒滴度高100倍。