[发明专利]一种通过检测斑马鱼组织肌酐含量评价化合物肾脏毒性的方法

摘要

本发明涉及一种通过检测斑马鱼组织肌酐含量评价化合物肾脏毒性的方法，以用于肾脏毒性研究。在利用斑马鱼胚胎模型进行化合物肾脏毒性作用的研究中，通过对胚胎组织中的肌酐成分进行提取，并利用液相色谱串联质谱方法测定其含量，作为评价胚胎肾脏功能的检测指标，从而建立一种快速、准确、特异性强的化合物肾脏毒性评价体系。

主权项

一种通过测定斑马鱼胚胎组织中肌酐的含量变化检测化合物肾脏毒性的方法，其特征在于，步骤如下：（1）将发育3～6天的斑马鱼胚胎移入含有待测化合物的培养水中，在28℃，14 h光照/10 h黑暗条件下培养24～72h，作为测试组，去除死亡胚胎，经纯水洗净胚胎表面残留液后，获得培育后胚胎，所述培育后胚胎距受精时间不超过7天；在相同条件下用培养水培养作为正常胚胎组；所述含有待测化合物的培养水为在培养水中加入待测化合物或待测化合物与助溶剂的混合；上述培养水组分为：NaCl 5mmol/L，KCl 0.17mmol/L，CaCl2 0.4mmol/L，MgSO4 0.16mmol/L，去离子水配制；（2）向培育后胚胎加入内标溶液，经匀浆、分层提取其中的极性组分，提取样品经氮吹干后，加入纯水溶解，然后过0.45 μm聚醚砜水相滤膜，将滤液注入LC‑MS/MS，进行分离分析；然后分别将肌酐标准品溶液及内标标准品溶液注入LC‑MS/MS，在相同条件下进行检测；胚胎样品中加入的内标物质为西咪替丁标准品溶液；（3）根据如下公式：C待测样品= C标准品×AA待测样品/AA标准品式中：C为提取样品浓度，AA为色谱峰面积；计算待测样品中的肌酐及内标含量，再根据内标提取率计算各组胚胎样品中的肌酐含量；（4）胚胎组织中肌酐含量以均值±标准差表示，采用独立样本t 检验法分析比较组间差异的显著性，在P<0.05显著性的水平下，当测试组胚胎组织中肌酐含量高于正常胚胎组胚胎组织中的肌酐含量，并超过相应发育龄胚胎组织肌酐含量的正常界值范围，说明胚胎肾脏功能受到损害，受试化合物具有肾脏毒性；上述各发育龄胚胎组织中肌酐含量的正常界值范围为：受精后4d斑马鱼组织中的肌酐水平为30.91～49.09 ng /50个胚胎；受精后5d斑马鱼组织中的肌酐水平为36.56～56.32 ng/50个胚胎；受精后6 d斑马鱼组织中的肌酐水平为58.38～82.06 ng/50个胚胎；受精后7d斑马鱼组织中的肌酐水平为84.47～124.81ng/50个胚胎。