[发明专利]一种利用新MVA途径合成异戊二烯的方法及其相应重组细胞和应用

摘要

本发明提供了一种利用新MVA途径合成异戊二烯的方法及其相应重组细胞，本发明旨在通过对传统甲羟戊酸途径进行改造，通过表达外源的脱羧酶及脱羟基酶基因，使传统利用MVA途径合成异戊二烯的总代谢途径由8步酶催化反应缩短为5步反应，建立一条新的生物合成异戊二烯的方法，从而获得含有乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸脱羧酶和3-甲基-3-丁烯-1-醇脱羟基酶对应的编码基因的重组细胞。该重组细胞能够从乙酰辅酶A合成异戊二烯，从而建立一条新的利用可再生资源葡萄糖为原料的生物催化生产异戊二烯的方法。

主权项

一种利用新MVA途径合成异戊二烯的方法，其特征在于它包括以下步骤：（1）依次构建分别含有mvaS基因、mvaE基因、OleT_JE 基因和OhyA_EM基因的载体pGH‑mvaS、pGH‑mvaE、pGH‑OleT_JE和pGH‑OhyA_EM；（2）构建载体pACY‑mvaE‑mvaS；将所述载体pGH‑OleT_JE与载体pCOLADuet‑1分别用BamHI 和SacI进行双酶切，酶切后的载体与OleT_JE基因片段按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pCOLA‑OleT_JE；扩增基因OleT_JE片段，将载体pBAD18与基因OleT_JE片段分别用NheI和SacI进行双酶切，酶切后的载体与两端带有相应酶切位点的OleT_JE基因片段按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pBAD‑OleT_JE；扩增基因OhyA_EM片段，将pCOLADuet‑1载体与基因OhyA_EM片段分别用BamHI 和 HindIII进行双酶切，酶切后的载体与OhyA_EM基因片段按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pCOLA‑OhyA_EM；所述pGH‑OhyA_EM与所述pCOLA‑OleT_JE分别用BglII 和XhoI进行双酶切，酶切后的载体pCOLA‑OleT_JE与外源基因片段OhyA_EM按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pCOLA‑OleT_JE‑OhyA_EM；所述pCOLA‑OleT_JE‑OhyA_EM和pET‑28a(+)载体分别用BamHI 和XhoI酶切，酶切后载体和基因片段OleT_JE‑OhyA_EM连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pET28‑OleT_JE‑OhyA_EM；扩增OhyA_EM片段，将载体pBAD‑OleT_JE与基因OhyA_EM片段分别用SalI和 HindIII进行双酶切，酶切后载体与两端带有相应酶切位点的OhyA_EM基因片段按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pBAD‑OleT_JE ‑OhyA_EM；（3）将载体pACY‑mvaE‑mvaS分别和重组质粒pCOLA‑OleT_JE‑OhyA_EM、重组质粒pET28‑OleT_JE‑OhyA_EM和重组质粒pBAD‑OleT_JE ‑OhyA_EM共同转化大肠杆菌，涂布于加有卡那霉素和氯霉素抗生素的LB固体平板，分别获得阳性克隆YJM32工程大肠杆菌、YJM33工程大肠杆菌和YJM34工程大肠杆菌；（4）活化后的上述工程大肠杆菌接种到含有卡那霉素、氯霉素或氨苄霉素的LB液体培养液中培养，当OD_600nm为0.6‑0.8时，在菌液中加入诱导剂至终浓度0.5 mmol·L^‑1，然后转入在30℃下继续诱导培养24h，发酵获得异戊二烯。