[发明专利]T‑DNA及其插入位点右臂侧翼基因组序列的扩增引物和鉴定方法

摘要

本发明涉及一种T‑DNA及其真菌插入位点右臂侧翼基因组序列的扩增引物和鉴定方法。本发明T‑DNA包括左臂、右臂DNA，以及二者之间的多克隆位点和eGFP基因，且该T‑DNA具有SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，本发明公开了其载体及构建方法；该T‑DNA的真菌插入位点右臂侧翼基因组序列的巢式PCR扩增的上游引物对应于eGFP基因的左端序列，下游引物对应于右臂的左端序列；该右臂侧翼基因组序列的鉴定方法包括基因组DNA提取、酶切处理、纯化处理、连接反应、巢式PCR扩增及其产物鉴定、克隆和测序等步骤。本发明引物特异性强，能够快速、准确、高效、稳定、普适性地扩增出T‑DNA的右臂侧翼基因组DNA序列，大大提高鉴定效率。

主权项

一种载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以带有真菌trpC启动子的潮霉素基因DNA序列代替植物pCAMBIA1300双元转化载体中T‑DNA左臂区中CaMV35S启动子和CaMV35S终止子之间的潮霉素基因DNA序列；(2)在T‑DNA多克隆位点右边添加一段eGFP基因，具体方法：①先将上步改造后的pCAMBIA1300双元转化载体采用限制性内切酶HindIII酶切，并对酶切产物切胶回收、酶切产物磷酸化和磷酸化后产物纯化处理，获得去磷酸化的具有HindIII粘性末端的双元转化载体线性DNA片段；②再以含有真菌eGFP基因的pHBt2载体为模板，采用引物对eGFP‑F/eGFP‑R PCR扩增pHBt2载体的eGFP基因，并把PCR产物克隆到pMD19‑T载体中，采用HindIII酶切回收含有HindIII粘性末端的eGFP基因克隆DAN片段；所述eGFP‑F引物序列为：5′‑ACAAGCTT GAATTGGGTA CTCAAATTGG TTC‑3′；所述eGFP‑R引物序列为：5′‑ACAAGCTT ATCATCATGC AACATGCATG TAC‑3′；③最后，将eGFP基因克隆DNA片段与上述具有HindIII粘性末端的双元转化载体线性DNA片段通过T4连接酶连接，实现T‑DNA多克隆位点右臂区一段eGFP基因添加，即完成T‑DNA区改造，改造后T‑DNA包括左臂DNA、右臂DNA，在左、右臂DNA之间还依次包括多克隆位点MCS和eGFP基因，从多克隆位点MCS到右臂DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。