[发明专利]获取绵羊激活素II型受体基因及其突变体的方法与应用

摘要

本发明公开了一种获取绵羊激活素II型受体(ActRIIB)基因及其突变体的方法与应用，包括克隆ActRIIB基因编码区全长cDNA序列；ActRIIB及其定点突变型慢病毒载体的构建；稳定表达ActRIIB及突变体的细胞系筛选。本发明在细胞水平发现ActRIIB突变体对绵羊原代成肌细胞具有增殖作用，为进一步探索ActRIIB在家畜肌肉细胞生长分化过程所涉及的分子机制研究奠定基础。

主权项

一种获取绵羊激活素II型受体（ActRIIB）基因及其突变体的方法，其特征在于，包括克隆ActRIIB基因编码区全长cDNA序列；ActRIIB基因的定点突变及慢病毒载体的构建；稳定表达ActRIIB基因及突变体细胞系的筛选；所述克隆ActRIIB基因编码区全长cDNA序列，采集绵羊肝脏组织，用Trizol试剂提取肝脏组织总RNA并反转录，设计克隆引物，P1：5’‑GGCACCGCGGAACATGACGGCGCCCTGGGCGGCCC‑3’，P2：5’‑GTGTCCTGGGCTTAGATGCTC GACTC‑3’，通过RT‑PCR方法扩增绵羊ActRIIB全长编码区序列，将符合预期大小片段克隆至pMD 18T载体，测序，阳性质粒命名为pMD 18T‑ActRIIB；所述的ActRIIB及其定点突变型慢病毒载体的构建，以pMD 18T‑ActRIIB质粒为模板，以引物P3：5’‑ATAGGATCCGCACCGCGGAACATGACGGCGCCCTG‑3’ (BamH I)，P4：5’‑GGCGCGGCCGCTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGATGCTCGACTC‑3’(NotI)，将ActRIIB亚克隆至慢病毒表达载体pLEX‑MCS中，获得慢病毒表达载体pLEX‑ActRIIB，可表达全长形式的绵羊ActRIIB；以引物P5：5’‑GCCGGATCCATGGCCCTCGCCCTCCTCTG‑3’(BamHI)，P6：5’‑CCCCTCGAGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTACACCTGGGGGTT CTCCTCG‑3’(XhoI)，亚克隆入慢病毒载体pLEX‑MCS，获得慢病毒表达载体pLEX‑dnActRIIB，可表达截短的ActRIIB，即第7‑100位氨基酸序列；将上下游分别是AgeI和XhoI酶切位点的IgG‑Fc基因片段，与经AgeI和XhoI双酶切的pLEX‑dnActRIIB大片段进行连接，获得重组质粒pLEX‑dnActRIIB‑IgG Fc，可表达带IgG‑Fc标签的截短型7‑100aa ActRIIB序列dnActRIIB‑IgG Fc；利用Stratagene定点突变试剂盒将dnActRIIB‑IgG Fc序列的第79位氨基酸赖氨酸（L）分别定点突变为脯氨酸（P）和谷氨酸（E），L79P定点突变正向引物是P7：5’‑GAAGGGCTGCTGGCCGGACGACTTCAACT‑3’，反向引物是P8： 5’‑AGTTGAAGTCGTCCGGCCAGCAGCCCTTC‑3’，L79E定点突变正向引物是P9： 5’‑CAAGAAGGGCTGCTGGGAGGACGACTTCAACTGC‑3’，反向引物是P10： 5’‑GCAGTTGAAGTCGTCCTCCCAGCAGCCCTTCTTG‑3’；分别构建获得pLEX‑dnActRIIB‑IgG Fc‑L79P、pLEX‑dnActRIIB‑IgG Fc‑L79E慢病毒重组表达质粒；所述稳定表达ActRIIB及突变体细胞系的筛选，是将构建的重组表达ActRIIB及突变体的慢病毒质粒转染293T细胞，进行慢病毒的包装，并感染分离培养的绵羊原代成肌细胞，获得稳定表达绵羊ActRIIB全长及突变体的成肌细胞系。