[发明专利]一种多基因转染嗜热四膜虫细胞株的构建方法及其应用

摘要

本发明公开了一种多基因转染嗜热四膜虫细胞株的构建方法及其应用。将靶基因A的同源序列克隆到打靶载体pNeo4中，经基因枪法转化营养期四膜虫，巴龙霉素抗性筛选获得大核基因遗传转化的阳性细胞株a；将靶基因B的同源序列克隆到打靶载体pBsr中，经基因枪法转化营养期四膜虫细胞株a，巴龙霉素配合杀稻瘟菌素抗性筛选，获得大核基因遗传转化的阳性细胞株a/b。该方法解决了现有多基因转染技术效率低、筛选过程复杂及耗时长等问题；并克服了现有技术无法获得必需基因缺失或突变细胞株的局限，可研究必需基因缺失或突变对相关基因表达及功能的影响。本发明可用于对两个不同目的基因进行敲除、突变或表位标注等定向修饰，从而实现四膜虫多基因联合应用研究。

主权项

一种多基因转染嗜热四膜虫细胞株的构建方法，其特征在于具体构建步骤包括：(1)将靶基因A的5′和3′同源序列通过酶切、连接的方法，分别克隆到含巴龙霉素抗性标记的打靶载体pNeo4中，经基因枪法转化营养期四膜虫，通过巴龙霉素抗性筛选及PCR单克隆鉴定，获得大核基因遗传转化的阳性细胞株a；(2)将靶基因B的5′和3′同源序列通过酶切、连接的方法，分别克隆到含杀稻瘟菌素抗性标记的打靶载体pBsr中，经基因枪法转化营养期四膜虫细胞株a，巴龙霉素配合杀稻瘟菌素抗性筛选：巴龙霉素与杀稻瘟菌素的初始浓度均为100μg/mL，随着杀稻瘟菌素浓度倍性增加，巴龙霉素浓度始终保持200μg/mL，直至杀稻瘟菌素达到终浓度800μg/mL，PCR单克隆鉴定获得大核基因遗传转化的阳性细胞株a/b。