[发明专利]一种以山葵子叶为外植体的遗传转化方法有效
申请号: | 201410353144.5 | 申请日: | 2014-07-23 |
公开(公告)号: | CN104140978B | 公开(公告)日: | 2017-02-15 |
发明(设计)人: | 王跃华;任三军;孙雁霞 | 申请(专利权)人: | 成都大学 |
主分类号: | C12N15/82 | 分类号: | C12N15/82 |
代理公司: | 四川君士达律师事务所51216 | 代理人: | 芶忠义 |
地址: | 610106 四*** | 国省代码: | 四川;51 |
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摘要: | 本发明公开一种以山葵子叶为外植体的遗传转化方法,包括下述步骤步骤1,农杆菌菌种的活化培养;步骤2,山葵无菌苗的获得;步骤3,山葵子叶的预培养;步骤4,山葵子叶的遗传转化;步骤5,山葵毛状根的快速增殖。其由发根农杆菌成功诱导山葵子叶实现遗传转化,获得了大量含有次生代谢产物、生长迅速、遗传稳定和能快速生长的毛状根。 | ||
搜索关键词: | 一种 子叶 外植体 遗传 转化 方法 | ||
【主权项】:
一种以山葵子叶为外植体的遗传转化方法,其特征在于包括如下步骤:步骤1,农杆菌菌种的活化培养:将发根农杆菌在YEB固体培养基上划线后,放在26~30℃的温度条件下进行暗培养24~36h后,挑取单菌落接入YEB液体培养基中,并于25~30℃振荡培养1~2天后,用于外植体浸染;所述的农杆菌为发根农杆菌A4或R1000,浸染山葵子叶外植体的菌液OD600=0.1~0.3;步骤2,山葵无菌苗的获得:将山葵种子放在超净工作台上,先用75%的酒精消毒20~40s,再用0.1%升汞消毒3~8min,无菌水冲洗2~5次后,将消毒后的山葵种子剥去种皮并接种在MS+6‑BA 0.5~4mg·L‑1+NAA0.5~2mg·L‑1+蔗糖20~50g·L‑1+琼脂3.5~4.5g·L‑1的培养基上,并在22~28℃,光强1000~2000lx,每天光照8~12h的条件下培养,获得山葵无菌苗;步骤3,山葵子叶的预培养:切取山葵无菌苗刚展开1‑4d的子叶作为外植体,接种于预培养基上,并进行预培养,预培养基是MS+2,4‑D 1~2mg·L‑1+KT 0.1~0.5mg·L‑1+腺嘌呤10~20mg·L‑1+蔗糖20~50g·L‑1+琼脂5~7g·L‑1,山葵子叶的预培养条件是在18~22℃、无光照条件下进行1~3d的预培养;步骤4,山葵子叶的遗传转化:选取预培养后的山葵子叶切口处产生膨大的外植体放入步骤1活化好的农杆菌菌液中浸染1~3分钟,使外植体与农杆菌充分接触后,并用无菌滤纸吸干外植体表面多余的菌液后,再转入共培养基中,在15~22℃的暗培养条件下进行1~3d的共培养,共培养基为1/2MS+邻苯二酚100~200mg·L‑1+蔗糖10~15g·L‑1+琼脂4~5.5g·L‑1;把共培养后的外植体转入含头孢噻肟钠200~500mg·L‑1的抗生素水中浸泡1~3小时后,再转入除菌培养基为1/2MS+IBA 0.1~0.5mg·L‑1+琼脂5~7g·L‑1+蔗糖15~30g·L‑1+头孢噻肟钠200~400mg·L‑1+头孢曲松钠200~400mg·L‑1中进行除菌培养,每隔2~4d转接一次除菌培养基,直到毛状根大量产生;步骤5,山葵毛状根的快速增殖:切取长度为1.5~3cm的毛状根转接至毛状根快速增殖培养基为1/2MS+IBA 0.1~0.5mg·L‑1+蔗糖10~20g·L‑1+头孢霉素100~300mg·L‑1的液体培养基上进行毛状根的快速增殖培养。
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