[发明专利]硼替佐米对K562细胞株中DNA甲基转移酶表达的检测方法

摘要

本发明公开了一种硼替佐米对K562细胞株中DNA甲基转移酶表达的检测方法，设置对照组与实验组：将K562细胞置于含10％灭活新鲜小牛血清RPMI-1640培养液，在37℃，体积分数为5％CO2、饱和湿度条件下培养，保持细胞活力＞97％，取指数生长期的K562细胞（1×105/ml）分为对照组与实验组（3）Annexin-V法流式细胞仪（FCM）检测K562细胞凋亡率。本申请的方法能确定硼替佐米对K562细胞株中DNA甲基转移酶表达的抑制效果，从而为硼替佐米在白血病中的研究提供了可靠依据。

主权项

一种硼替佐米对K562细胞株中DNA甲基转移酶表达的检测方法，其特征在于：（1）设置对照组与实验组：将K562细胞置于含10％灭活新鲜小牛血清RPMI‑1640 培养液，在37 ℃，体积分数为5％CO2、饱和湿度条件下培养，保持细胞活力＞ 97％，取指数生长期的K562细胞（1×105/ml）分为对照组与实验组，实验组分别加入6nmol/L、20nmol/L和60 nmol/L的硼替佐米，分别作用时间分别为12 h、24 h和36 h；对照组加入无硼替佐米的细胞培养液，相同条件下培养；本步骤获得以下实验组和对照组：A 组，不加任何处理的对照组；B 组，6 nmol/L 硼替佐米处理组；C 组，20 nmol/L 硼替佐米处理组；D 组，60nmol/L 硼替佐米处理组；（2）蛋白印迹法检测胞内DNMT1 表达：收集硼替佐米作用12 h 后的各处理组细胞，Western 及IP细胞裂解液提取胞内蛋白，参照试剂盒说明用BCA方法测定蛋白浓度，并调节浓度，每泳道取100 μg上样，于10％十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS‑PAGE）后，电转至硝酸纤维膜，以β‑actin 为内参蛋白，加入兔抗人DNMT1 多克隆抗体、β‑actin 一抗，碱性磷酸酶标记山羊抗兔二抗，BCIP/NBT 碱性磷酸酯酶显色试剂盒显色，采用BandScan 软件分析各组蛋白条带与相应β‑actin 的A 值之比；实验重复3 次；（3）Annexin‑V 法流式细胞仪（FCM）检测K562细胞凋亡率：收集硼替佐米各浓度处理12‑36 h 的K562 细胞1×106 个，用磷酸盐缓冲液洗涤2次， 离心弃上清，加入100 μl Binding Buffer 和FITC 标记的Annexin‑V （20 mg/L）10 μl，室温避光30 min，再加入PI（50 mg/L）5 μl，避光反应5 min后，加入400 μl Binding Buffer，立即用FCM 进行定量检测，同时以不加AnnexinV‑FITC 及PI 的一管作为阴性对照，单纯FITC 阳性（FITC＋/PI‑）细胞群为早期凋亡细胞。