[发明专利]一种R-3-氨基丁醇的生物制备方法

摘要

一种R-3-氨基丁醇的生物制备方法，按照人工设计如SEQIDNO：1所示的序列进行全基因合成，克隆入pET24a得到重组表达载体；将重组表达载体转入大肠杆菌获得可以重组D-转氨酶基因工程菌；对该菌进行培养制备重组D-转氨酶；反应溶液中加入终浓度为10-300mmol/L的3-羰基丁醇、质量百分浓度为2-15%的二甲基亚砜或乙腈、终浓度为0.1-1mmol/L的磷酸吡哆醛，终浓度为0.02-1mol/L的异丙胺或D-丙氨酸和质量百分浓度为0.01-1%的重组D-转氨酶组成反应体系进行反应；反应结束后提取反应液中的R-3-氨基丁醇；本发明成本低，转化率达到97%以上和产物得率大于87%，没有副产物，更适合工业应用。

主权项

一种R‑3‑氨基丁醇的生物制备方法，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：步骤一、重组D‑转氨酶基因工程菌的制备按照人工设计如SEQ ID NO：1所示的序列进行全基因合成，克隆入pET24a的Nde I 和Hind III位点；转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导表达重组D‑转氨酶的重组D‑转氨酶基因工程菌；步骤二、重组D‑转氨酶的制备将重组D‑转氨酶基因工程菌接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃培养16h，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素抗性的TB液体培养基中，接种量为含卡那霉素抗性的TB液体培养基体积的1%；然后置于37℃下培养至OD600值为0.4‑1.0，加入异丙基‑β‑D‑半乳糖苷或乳糖，置于28‑30℃继续培养16‑24h后，离心收集菌体；采用磷酸盐缓冲液将收集后的菌体洗一次之后重悬，将悬浮液置于冰浴中超声破碎后再离心，所得上清液即为重组D‑转氨酶，检测其中的蛋白含量，备用；步骤三、R‑3‑氨基丁醇的制备在反应溶液中依次加入终浓度为10‑300mmol/L的底物、质量浓度为2‑15%的助溶剂、终浓度为0.1‑1mmol/L的辅因子、终浓度为0.02‑1mol/L的氨基供体和质量浓度为0.2‑0.4%的重组D‑转氨酶组成反应体系；将该反应体系在25‑30℃的条件下反应24‑26h；反应结束后，检测反应液中R‑3‑氨基丁醇的含量；然后用乙酸乙酯或二氯甲烷提取反应液中的R‑3‑氨基丁醇，用旋转蒸发除去乙酸乙酯或二氯甲烷，即得到R‑3‑氨基丁醇；所述底物为3‑羰基丁醇；所述的反应溶液为pH为7.0‑10.0的50‑100mmol/L磷酸盐缓冲液、Tirs缓冲液或碳酸氢盐缓冲液；所述的助溶剂为二甲基亚砜或乙腈；所述的辅因子为磷酸吡哆醛；所述的氨基供体为异丙胺或D‑丙氨酸。