[发明专利]一种基于磁性Fe3O4@Au复合纳米材料电化学检测人免疫球蛋白E的方法

摘要

一种基于磁性Fe3O4@Au复合纳米材料电化学检测人免疫球蛋白E(hIgE)的方法，通过一步还原法制备出Fe3O4@Au复合纳米材料，在该材料上标记hIgE抗体；然后将该材料与hIgE、生物素化hIgE适配体混合，形成hIgE抗体-hIgE-hIgE适配体复合物；再将亲合素化碱性磷酸酶吸附到复合物上，通过碱性磷酸酶的生物催化沉积反应，使银离子在磁性Fe3O4@Au复合纳米材料表面催化还原成银单质并沉积到该复合纳米材料表面。通过检测银单质的溶出伏安电流值，实现对hIgE的检测。本发明中磁性Fe3O4@Au复合纳米材料粒径为35-45nm，且粒径分布均匀，具有超顺磁性。

主权项

一种基于磁性Fe3O4@Au复合纳米材料电化学检测hIg E的方法，包括如下步骤：步骤1：磁性Fe3O4纳米材料的制备称取2.50g FeSO4·7H2O溶30 mL纯水中，加入10 mL 50g/L 聚乙二醇‑20000（PEG‑20000）溶液，搅拌均匀；在不断搅拌条件下逐滴滴加30 mL 2.5%稀氨水溶液，继续加入270 μL 30% H2O2溶液并转移至高压反应釜中，于160℃下恒温反应5‑7 h后，磁分离洗涤，70℃烘干，即得Fe3O4纳米粒子；其特征在于：还包括以下步骤：步骤2：Fe3O4@Au复合纳米材料的制备称取10 mg步骤1制备的Fe3O4纳米粒子，用120 mL 50 g/L的PEG‑20000溶液超声分散均匀；搅拌条件下加入1mL 1.0%氯金酸溶液，反应1‑2 h；加入5 mL 80 mmol/L盐酸羟胺溶液后，继续反应1 h；依次用50 g/L 的PEG‑20000溶液和纯水磁分离洗涤3次，即得Fe3O4@Au复合纳米材料；步骤3：hIg E标记Fe3O4@Au复合纳米材料的制备将步骤2制备的Fe3O4@Au复合纳米材料重悬于纯水中，调节浓度为1 mg/mL；在5 mL Fe3O4@Au复合纳米材料溶液中，搅拌条件下逐滴加入100 μL hIg E抗体溶液后，于37℃孵育2 h，然后加入牛血清白蛋白（BSA）封闭1 h；磁分离后，沉淀用含1% BSA pH7.4的PBS溶液洗涤两次，即得hIg E标记Fe3O4@Au复合纳米材料；步骤4：hIg E的电化学检测将步骤3制备的hIg E标记Fe3O4@Au复合纳米材料重悬于含1% BSA的pH7.4的PBS溶液中，调节浓度为1 mg/mL；在200 μL hIg E标记Fe3O4@Au复合纳米材料的溶液中，加入10 μL含不同浓度hIg E溶液和10 μL 10μg/mL生物素化hIg E适配体溶液于37℃孵育0.5 h，免疫反应完成后，磁分离，所得沉淀用PBS洗涤3次，并重悬于pH为7.4的190 μL PBS中，随后加入10 μL 10 μg/mL亲和素标记的碱性磷酸酶，于37℃孵育15 min，用pH9.0的甘氨酸‑NaOH缓冲溶液磁分离洗涤3次；再加入200 μL 含有2 mmol/L 抗坏血酸磷酸酯和1 mmol/L AgNO3的甘氨酸‑氢氧化钠缓冲液，避光反应15 min，在磁场中用移液枪小心吸走上层溶液，所得沉淀用pH9.0的甘氨酸‑NaOH缓冲溶液洗涤3次，加入300 μL 1.5 mol/L HNO3将单质银全部溶解后，将溶液转移至5 mL小烧杯中，再加入1 mL含0.6 mol/L KNO3的0.1 mol/L HNO3溶液；以玻碳电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在电化学工作站上在进行恒电位沉积120s，再在溶液中进行线性扫描LSV，扫描范围‑0.6~0.25V，扫描速率50 mV/s，得到单质银的溶出伏安电流值；根据单质银的溶出伏安电流值大小实现对hIg E的定量检测。