[发明专利]一种抗肿瘤药物筛选细胞模型及其应用

摘要

一种抗肿瘤药物筛选细胞模型及其应用，属于生物工程技术领域。抗肿瘤药物筛选细胞模型是从胶质母细胞瘤中分离的、定点整合了报告基因的肿瘤干细胞，含有A－B－C－D结构的DNA构建物，其中A，D为胶质母细胞瘤干细胞分子标记基因启动子及下游序列，B为报告基因序列，C为嘌呤霉素抗性基因puro序列；胶质母细胞瘤干胞分子标记基因是包括Nestin基因；报告基因包括绿色荧光蛋白基因GFP、或红色荧光蛋白基因RFP、及荧光素酶报告基因luciferase。该抗肿瘤药物的细胞模型用于筛选细胞毒性和诱导分化的物质。有益效果在于1、避免了传统的细胞转基因方法的不利影响，检测结果将能正确反映药物作用效果。2、获得抗肿瘤干细胞的化合物。

主权项

一种抗肿瘤药物筛选细胞模型，其特征在于该抗肿瘤药物筛选细胞模型是从胶质母细胞瘤中分离的、定点整合了报告基因的肿瘤干细胞，含有A－B－C－D结构的DNA构建物，其中：A，D为胶质母细胞瘤干细胞分子标记基因启动子及下游序列，B为报告基因序列，C为嘌呤霉素抗性基因puro序列；胶质母细胞瘤干细胞分子标记基因是Nestin基因；报告基因包括绿色荧光蛋白基因GFP、或红色荧光蛋白基因RFP、或荧光素酶报告基因luciferase；该抗肿瘤药物筛选细胞模型经如下步骤得到：a.将报告基因序列连接到pENTR‑u6载体上，获得包含报告基因序列的LR重组入门载体；b.将IRES序列或者2A肽序列连接到(a)获得的载体上，IRES或者2A肽序列位于报告基因终止密码子之后；c.将嘌呤霉素抗性基因puro连接到(b)获得的载体上，puro基因序列位于IRES或者2A肽序列序列下游，与报告基因一同受nestin启动子驱动，用于同源重组阳性细胞的筛选；d.将nestin启动子序列连接到(c)获得的载体上，nestin启动子序列位于报告基因上游，作为同源重组时的所需的5′同源臂；e.将nestin启动子下游序列连接到(d)获得的载体上，nestin启动子下游序列位于puro基因下游，作为同源重组时所需的3′同源臂；f.将(e)得到的gateway入门载体与腺病毒基因组载体pAd‑BLOCK‑iT‑DEST进行gateway克隆的LR反应，获得包含所述构建物的pAd‑BLOCK‑iT‑DEST腺病毒载体；g.设计针对nestin第一外显子的转录激活因子样效应物核酸酶，验证其效率之后，克隆至gateway入门载体pENTR‑u6中；h.将(g)所获得的gateway入门载体与腺病毒基因组载体pAd‑BLOCK‑iT‑DEST进行gateway克隆的LR反应，获得包含talen的pAd‑BLOCK‑iT‑DEST腺病毒载体；i.将(f)和(h)获得的腺病毒载体线性化后分别转染293A细胞，包装腺病毒；j.将(i)获得的腺病毒共同感染人胶质瘤肿瘤干细胞，培养感染后的细胞，puro筛选3周后，在显微镜下挑取带报告基因的单克隆，培养成细胞系。