[发明专利]一种检测卷烟主流烟气总粒相物的体外细胞微核方法

摘要

本发明是一种检测卷烟主流烟气总粒相物的体外细胞微核方法。该方法是将细胞种植在96孔板上进行卷烟烟气染毒后直接固定、染色、上高内涵成像系统进行检测。根据细胞核的荧光值与背景荧光值之差设置细胞主核及微核荧光强度参数，测量细胞主核及微核的大小设置核直径参数，根据细胞核之间的距离设置距离参数。根据以上设定对图片进行分析，在结果导出栏选择具有微核的双核细胞数及双核细胞总数，从而计算出微核率。本方法需要的细胞量少，不需要消化细胞和制作微核片，并且检测速度快，样本量大、准确率高。

主权项

一种检测卷烟主流烟气总粒相物的体外细胞微核方法，其特征在于该方法包括以下步骤：（1）按照烟草国标方法平衡卷烟，选取重量和吸阻一致的烟支，全自动转盘式吸烟机上抽吸20支卷烟， 用剑桥滤片捕集器中剑桥滤片捕集烟气的总粒相物，将剑桥滤片用DMSO浸泡，超声波提取20 min，最后定容至 10 mg TPM/ml DMSO，‑80℃低温保存备用；（2）按常规方法传代培养CHO细胞，待细胞长满时将细胞密度约5×104个细胞/ml的 CHO细胞种于96孔板，置于37℃、体积浓度5％CO2培养箱中培养24 h；（3）用25‑200μg/ml的TPM处理处于对数生长期的CHO细胞培养物，每组设三个平行，所有组中都加入终浓度为6μg/ml的细胞松弛素B以对细胞分裂进行阻断，置于37℃、体积浓度5％CO2培养箱中培养24 h；（4）用PBS 洗涤生长于96孔板上的CHO细胞，接着用质量浓度4％多聚甲醛溶液固定10 min，用PBS洗涤2次；（5）用含0.2％TritonX‑100的PBS溶液透化固定细胞10 min，PBS洗涤细胞2次，洗涤时间不少于5min；（6）用0.1μg/ml FITC染料对细胞质进行染色，染色20 min，再用PBS洗涤96孔板2次；（7）用含1μg/ml DAPI、100 ug/ml RNase A的PBS对细胞核进行染色20 min；（8）用高内涵成像系统进行检测，选择FITC和DAPI荧光双通道对细胞进行扫描获取图片；（9）在图片扫描完成后使用微核分析软件进行分析，根据细胞核的荧光值与背景荧光值之差设置细胞主核及微核荧光强度参数，测量细胞主核及微核的大小设置核直径参数，根据细胞核之间的距离设置距离参数，根据以上设定对图片进行单核细胞、双核细胞、多核细胞进行分类识别，在结果导出栏选择具有微核的双核细胞数及双核细胞总数，从而计算出微核率；同时将DAPI与FITC通道获取的图片重叠在一张图片上以观察完整的细胞状态，从而对分类识别的结果进行验证。