[发明专利]红竹体细胞胚胎发生的方法

摘要

本发明公开了红竹Phyllostachys iridescens体细胞胚胎发生的方法，它是通过将外植体适宜消毒后，在诱导培养基上诱导出胚性愈伤组织，胚性愈伤组织经增殖培养后首先在胚状体诱导培养基上形成胚状体，然后在萌发培养基上形成再生植株，最后再生植株经过壮苗培养、炼苗后移栽成活。本发明解决了红竹体细胞胚胎发生的难题，为实现红竹的转基因研究、原生质体再生等生物技术育种奠定了基础。

主权项

红竹Phyllostachys iridescens体细胞胚胎发生的方法，其特征在于，包括：外植体消毒，胚性愈伤组织诱导与增殖，胚状体诱导与萌发，以及壮苗、炼苗和移栽的过程，具体步骤如下：(1)外植体消毒：选择健康饱满的种实，先用75％体积比的乙醇浸泡消毒1min；再用每升加5‑6滴吐温‑80的0.2％次氯酸钠浸泡消毒15‑20min，期间振荡3‑4次；然后用无菌水冲洗5‑6次；最后用无菌纸吸干表面水分，接种备用；(2)胚性愈伤组织诱导与增殖：将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，暗培养30‑50d使愈伤组织形成，愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础，添加1.0‑6.0mg/L的2，4‑D、0.01‑1.0mg/L的picloram、0.1‑5.0mg/L的ZT、8.0g/L的卡拉胶、300mg/L的脯氨酸、300mg/L的谷氨酰胺、200mg/L的水解酪蛋白；然后将淡黄色致密的胚性愈伤组织分离出来，接种到增殖培养基上，暗培养60‑90d使胚性愈伤组织增殖，每30d转接一次，增殖培养基是以MS培养基为基础，添加1.0‑6.0mg/L的2，4‑D、0.01‑1.0mg/L的picloram、8.0g/L的卡拉胶、300mg/L的脯氨酸、300mg/L的谷氨酰胺、200mg/L的水解酪蛋白；(3)胚状体诱导与萌发：将增殖后的胚性愈伤组织接种到胚状体诱导培养基上，暗培养10‑20d，使胚状体形成，胚状体诱导培养基是以MS培养基为基础，添加1.0‑8.0mg/L的ZT、0.1‑5.0mg/L的NAA、0.1‑5.0mg/L的GA、30g/L的蔗糖、8g/L的卡拉胶；然后将胚状体接种到萌发培养基上，光照培养20‑30d，胚状体逐渐萌发形成再生植株，萌发培养是以MS培养基为基础，添加0.1‑5.0mg/L的NAA、0.1‑5.0mg/L的GA、300mg/L的脯氨酸、300mg/L的谷氨酰胺、200mg/L的水解酪蛋白、8g/L的卡拉胶；光照时间12h/d，光照强度1000‑2000lux(4)壮苗、炼苗和移栽：将体细胞胚胎再生的小植株接种到壮苗培养基上培养20‑30d，开瓶炼苗5‑7d，取出小苗清洗根部的培养基，再用0.1％的高锰酸钾溶液清洗根部，然后将小苗栽植到灭菌的介质中，遮阴散射光培养一个月后，幼苗成活；壮苗培养基是以MS培养基为基础，添加1.0‑4.0mg/L的NAA、0.2‑0.5mg/L的TDZ、8g/L的卡拉胶。