[发明专利]高通量筛选玉米内参基因的方法

摘要

本发明公开了一种高通量筛选玉米内参基因的方法，该方法利用源于具有高度多样性的不同玉米自交系、不同组织、不同发育时期以及不同胁迫处理后构建的高通量转录组测序(RNA-seq)数据库，大规模分析整个转录组的表达情况，筛选在不同发育时期、不同条件下表达最恒定的基因作为内参基因，为转录组表达研究提供准确的对照。本方法利用整个转录组数据，分析全基因组所有表达的基因，系统性地筛选玉米内参基因，相对传统筛选方法更加准确、可靠。

主权项

高通量筛选玉米内参基因的方法，其特征在于：选择源于具有高度多样性的不同玉米自交系、不同组织、不同发育时期以及不同胁迫处理后构建的高通量转录组测序(RNA‑seq)数据库，其筛选步骤如下：(1)利用SolexaQA软件将RNA‑seq的数据进行过滤，除去比较差的数据，留下质量较高的序列；(2)利用Bowtie软件将得到的序列锚定到参考基因组上，当一个序列能够锚定到基因组上的不同位点，则除去该序列，只选择在基因组中有单一位点的序列；(3)使用Cufflinks软件计算各转录本的FPKM值(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)，去掉FPKM小于10的转录本，余下的转录本用于后续分析；(4)利用NormFinder软件计算所有基因在不同条件下的表达稳定性系数，选取不同数据库中都能达到前20％稳定表达的基因，并整合分析不同品种、不同组织、不同发育时期以及不同胁迫处理后得到的所有RNA‑seq数据库，筛选在不同数据库中都能稳定表达的基因作为候选内参基因；(5)选取不同品种进行胁迫处理，在不同发育时期取样提取RNA，根据候选内参基因的序列设计特异引物，通过qPCR检测候选内参基因及现有内参基因的表达水平，利用NormFinder软件计算各内参基因在不同条件下的表达稳定性系数，比较候选内参基因与现有内参基因在不同材料及不同处理条件下的表达稳定性，选择最优内参基因。