[发明专利]人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用，该检测卡包括底板、样品垫、吸水垫、结合垫和检测层；结合垫包被有量子点标记的抗人肺炎链球菌纳米探针；检测层是由带有一条检测线以及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；检测线包被有鼠抗人肺炎链球菌PspA蛋白多克隆抗体；质控线包被有抗兔IgG；检测层粘贴在底板上；结合垫和吸水垫分别设置在检测层两端部上方且与检测层部分重叠后分别与检测层和底板粘贴；样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴。本发明具有操作简便、检测快速、可定量及高灵敏度等优点。

主权项

一种人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：1)结合垫的制备：1.1)重组PspA1‑His、PspA2‑His融合蛋白的制备、纯化：1.1.1)对人肺炎链球菌Fam1PspA、Fam2PspA蛋白进行生物信息学分析，分别获取人肺炎链球菌Fam1PspA、Fam2PspA蛋白胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段，找到其对应的基因序列；1.1.2)在步骤1.1.1)中所得到的基因序列的5’端引入酶切位点NdeI、在3’端引入终止信号TAA和酶切位点XhoI后分别化学合成全基因序列，同时分别标记为PspA1、PspA2；所述PspA1基因序列是：CATATGGTAAGAGCAGAAGAATCTCCCGTAGCCAGTCAGTCTAAAGCTGAGAAAGACTATGATGC     NdeIAGCAGTGAAAAATGCTACAGCTGCAAAAAAAGCAGCAGAAGACGCTCAAAGAGCTTTAGATGAAGCAAAAGCTGCGCAGAAAAAATATGACGAGGATCAAAAGAAAACTGAGGAGAAAGCGAAAGAAGTAAAAAAAGCTTCGGAAGAAGAACAAGCTGCAAATCTGAAATATCAACAAGAGTTGGTTAAATATATTAAATATACACGTGAAAATAATTCAACAAAAAGAACTGAAGCTGAGAAAGTAATGACTGCAGCTAAGAAAGAGCATGAGAAAAAACAAACAGAACTTGCTAAAGTTCTCGCAAAGGTAATTCCTAGCGCGGAAGAATTAGAAAATACTAGACAAAAAGCAGAGAAAGCTAAAGAAAAAGAACCAGAGCTTACTAAAAAACTAGAAGAAGCTAAAGCAAAATCAGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCTACTGAAGCCAAACAAAAAGTGGATGCAGAACATGCTGAAGAAGTCGTTCCTCAAGCTAAAATCGCTGAGTTGGAAAATGAAGTTCAGAAACTAGAAAAAGATCTCAAAGAGATTGATGAATCTGACTCAGAAGATTATGTTAAAGAAGGTCTCCGTGCTCCTCTTCAATCTGAATTGGATGCCAAACAAGCTAAACTATCAAAACTTGAAGAGTTGAGTGATAAGATTGATGAGTTAGACGCTGAAATTGCAAAACTTGAAAAAAATGTAGAAGATTTCAAAAACTCAAACGGTGAGCAAGCTGAACAATACCGTGCTGCAGCTGGAGAAGACTTAGCTGCTAAACAAGCTGAATTAGAAAAAACTGAAGCTGACCTTAAGAAAGCAGTTAATGAGCCAGAAAAACCAGCTCCAGCTCCAGAAACTCCAGCCCCAGAAGCACCAGCTGAACAACCAAAACCAGCGCCGGCTCCTCAACCAGCTCCCGCACCCAAACCAGAGAAGCCAGCTGAACAACCCAAAGCAGAAAAACCAGCTGATCAACAAGCTGAAGAAGACTATGATCGTAGATCAGAAGAAGAATATAACCGCTTGACCCAACAGCAACCGCCAAAAGCAGAAAAACCAGCTCCTGCATAACTCGA                                                         XhoI G所述PspA2基因序列是：CATATGCCTACTTTTGTAAGAGCAGAAGAATCTCCACAAGTTGTCGAAAAATCTTCATTAGAGAAGA    NdeIAATATGAGGAAGCAAAAGCAAAAGCTGATACTGCCAAGAAAGATTACGAAACGGCTAAAAAGAAAGCAGAAGACGCTCAGAAAAAGTATGAAGATGATCAGAAGAGAACTGAGGAGAAAGCTCGAAAAGAAGCAGAAGCATCTCAAAAATTGAATGATGTGGCGCTTGTTGTTCAAAATGCATATAAAGAGTACCGAGAAGTTCAAAATCAACGTAGTAAATATAAATCTGACGCTGAATATCAGAAAAAATTAACAGAGGTCGACTCTAAAATAGAGAAGGCTAGGAAAGAGCAACAGGACTTGCAAAATAAATTTAATGAAGTAAGAGCAGTTGTAGTTCCTGAACCAAATGCGTTGGCTGAGACTAAGAAAAAAGCAGAAGAAGCTAAAGCAGAAGAAAAAGTAGCTAAGAGAAAATATGATTATGCAACTCTAAAGGTAGCACTAGCGAAGAAAGAAGTAGAGGCTAAGGAACTTGAAATTGAAAAACTTCAATATGAAATTTCTACTTTGGAACAAGAAGTTGCTACTGCTCAACATCAAGTAGATAATTTGAAAAAACTTCTTGCTGGTGCGGATCCTGATGATGGCACAGAAGTTATAGAAGCTAAATTAAAAAAAGGAGAAGCTGAGCTAAACGCTAAACAAGCTGAGTTAGCAAAAAAACAAACAGAACTTGAAAAACTTCTTGACAGCCTTGATCCTGAAGGTAAGACTCAGGATGAATTAGATAAAGAAGCAGAAGAAGCTGAGTTGGATAAAAAAGCTGATGAACTTCAAAATAAAGTTGCTGATTTAGAAAAAGAAATTAGTAACCTTGAAATATTACTTGGAGGGGCTGATCCTGAAGATGATACTGCTGCTCTTCAAAATAAATTAGCTGCTAAAAAAGCTGAGTTAGCAAAAAAACAAACAGAACTTGAAAAACTTCTTGACAGCCTTGATCCTGAAGGTAAGACTCAGGATGAATTAGATAAAGAAGCAGAAGAAGCTGAGTTGGATAAAAAAGCTGATGAACTTCAAAATAAAGTTGCTGATTTAGAAAAAGAAATTAGTAACCTTGAAATATTACTTGGAGGGGCTGATTCTGAAGATGATACTGCTGCTCTTCAAAATAAATTAGCTACTAAAAAAGCTGAATTGTAACTCGAG                                                           XhoI1.1.3)将步骤1.1.2)中所得到的PspA1、PspA2按分子生物学方法分别克隆入表达载体pET‑28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组PspA1‑His、PspA2‑His融合蛋白；所述重组PspA1‑His、PspA2‑His融合蛋白均以可溶性表达形式存在于基因工程菌体中；1.1.4)用镍柱纯化步骤1.1.3)所得到的重组PspA1‑His、PspA2‑His融合蛋白，SDS‑PAGE检测其纯度后，再以Bradford法测定蛋白质浓度，调整二种蛋白浓度均为0.2mg/mL后备用；1.2)兔及鼠抗人肺炎链球菌Fam1PspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗体IgG的制备：1.2.1)以步骤1.1.4)中所得到的重组PspA1‑His、PspA2‑His融合蛋白为完全抗原，分别免疫新西兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗人肺炎链球菌Fam1PspA、Fam2PspA蛋白抗血清及鼠抗人肺炎链球菌Fam1PspA、Fam2PspA蛋白抗血清；所述兔抗人肺炎链球菌Fam1PspA、Fam2PspA蛋白抗血清及鼠抗人肺炎链球菌Fam1PspA、Fam2PspA蛋白抗血清的间接ELISA效价均大于1×105；1.2.2)采用Protein G亲和层析柱分别纯化兔抗人肺炎链球菌Fam1PspA、Fam2PspA蛋白抗血清及鼠抗人肺炎链球菌Fam1PspA、Fam2PspA蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG；1.2.3)用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1.2.2)所得到的四种多克隆抗体IgG的浓度，将其蛋白浓度均调整为3mg/mL后备用；1.3)量子点标记的抗人肺炎链球菌纳米探针的制备与纯化：1.3.1)向微量离心管中依次加入4nmol量子点、600nmol N‑羟基琥珀酰亚胺和600nmol碳二亚胺，以磷酸盐缓冲液定容为2ml，于旋转混合仪中，以15rpm，37℃反应30min后，透析去除过量的N‑羟基琥珀酰亚胺以及碳二亚胺；所述磷酸盐缓冲液中各组分含量分别为：2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠以及2g/L氯化钠；所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.3；1.3.2)在活化的量子点中，加入4‑16nmol的步骤1.2)所制备的兔抗人肺炎链球菌Fam1PspA蛋白多克隆抗体IgG，避光反应2h，加入端氨基化聚乙二醇至终浓度为1.5％，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h；用0.2μm PES滤器过滤除去抗体聚集物，然后将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，除去未发生偶联反应的抗体和反应中的副产物；收集超滤离心管滤膜上层量子点‑抗体偶联物溶液，溶于2ml磷酸盐洗涤液中，再将此溶液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，收集超滤离心管滤膜上层量子点‑抗体偶联物溶液，溶于1ml磷酸盐保存液中，至此制得量子点标记的抗人肺炎链球菌Fam1PspA蛋白多克隆抗体IgG；所述磷酸盐洗涤液中各组分含量分别为：2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、5ml/L吐温‑20以及1g/L叠氮钠；所述磷酸盐洗涤液的pH＝7.3；所述磷酸盐保存液中各组分含量分别为：2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、10g/L BSA以及1g/L叠氮钠；所述磷酸盐保存液的pH＝7.3；1.3.3)按照与步骤1.3.1)以及步骤1.3.2)相同的方法，利用步骤1.2)所制备的兔抗人肺炎链球菌Fam2PspA蛋白多克隆抗体IgG制得量子点标记的抗人肺炎链球菌Fam2PspA蛋白多克隆抗体IgG；1.3.4)将上述含量子点标记的抗人肺炎链球菌Fam1PspA蛋白多克隆抗体IgG的溶液与含量子点标记的抗人肺炎链球菌Fam2PspA蛋白多克隆抗体IgG的溶液按体积比1：1混合，即制得量子点标记的抗人肺炎链球菌纳米探针，备用；1.4)量子点标记抗体的负载：将聚酯纤维膜浸入步骤1.3.4)所得到的量子点标记的抗人肺炎链球菌纳米探针溶液中1h，取出，25℃干燥后4℃密封保存备用，至此制得结合垫；2)样品垫的制备：取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3h，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，25℃密封干燥保存；至此制得样品垫；所述样品垫处理液中各组分含量分别为：2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、20g/L牛血清白蛋白、10ml/L吐温‑20、20g/L蔗糖以及5g/L聚乙烯吡咯烷酮；所述样品垫处理液的pH＝7.3；3)检测层的制备：3.1)将步骤1.2.3)中制备的鼠抗人肺炎链球菌Fam1PspA蛋白多克隆抗体IgG溶液与鼠抗人肺炎链球菌Fam2PspA蛋白多克隆抗体IgG溶液按体积比1:1混合，制得鼠抗人肺炎链球菌PspA蛋白多克隆抗体后备用；3.2)将步骤3.1)制备的鼠抗人肺炎链球菌PspA蛋白多克隆抗体与抗兔IgG用磷酸盐缓冲液均调整至终浓度为0.5‑2.5mg/mL后备用；所述磷酸盐缓冲液中各组分含量分别为：2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠以及2g/L氯化钠，所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.3；3.3)将稀释好的鼠抗人肺炎链球菌PspA蛋白多克隆抗体装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0.8‑2.5μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0.8‑2.5μl/cm的量按照与检测线0.5‑0.8cm的间隔喷于硝酸纤维素膜上作为质控线；3.4)将喷有检测线以及质控线的硝酸纤维素膜在37℃干燥2h，4℃密封干燥保存；至此制得检测层；4)底板的制备将PVC材质的底板按实际要求裁剪后备用；5)吸水垫的制备将吸水滤纸按实际要求裁剪后备用；6)人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡的组装：6.1)将步骤4)所制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉；6.2)将步骤3)所制备得到的检测层粘贴到底板的中部区域，并抹平膜面；6.3)将步骤5)所制备得到的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层有部分重叠，同时将其右边缘与底板的右边缘对齐粘好并抹平；6.4)将步骤1)所制备得到的结合垫按部分重叠的方式重叠于硝酸纤维素膜的左边缘处，同时将结合垫粘于底板上；6.5)将步骤2)所制备得到样品垫按部分重叠的方式重叠于结合垫的左边缘处，另一边与底板的左边缘对齐，粘于底板上并抹平；6.6)将组装好的人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡进行裁剪，4℃密封干燥避光保存；所述步骤6.1)至步骤6.6)均是在生物安全柜内进行操作。