[发明专利]同时分离培养犬骨髓间充质干细胞和多功能造血干细胞的方法

摘要

本发明涉及犬干细胞分离培养技术，尤其是体外同时分离培养犬骨髓间充质干细胞和多功能造血干细胞的技术。本发明的特征在于在分离骨髓单个核细胞的基础上，贴壁培养原代间充质干细胞的同时，采用半量换液，再加入单个核细胞培养悬液的方法，即利用贴壁生长的间充质干细胞所提供的造血微环境培养悬浮生长的多功能造血干细胞，从而达到同时分离培养犬骨髓间充质干细胞和多功能造血干细胞的目的。

主权项

一种分离培养犬骨髓间充质干细胞和多功能造血干细胞的方法，其特征在于在分离骨髓单个核细胞的基础上，贴壁培养原代间充质干细胞的同时，采用半量换液，再加入单个核细胞培养悬液的方法，即利用贴壁生长的间充质干细胞所提供的造血微环境培养悬浮生长的多功能造血干细胞，从而达到同时分离培养犬骨髓间充质干细胞和多功能造血干细胞的目的，具体操作步骤如下：步骤 1、BMMSCs和HSCs的体外分离：常规麻醉实验犬，髂后上棘备皮、消毒、铺巾，用含1ml肝素钠的骨髓穿刺针分2～3点共抽取骨髓约10ml，混匀防凝，迅速转入50ml 消毒离心管，用等量DMEM/F12稀释混匀；取10支底部加入5ml 淋巴细胞分离液的离心管，加入的淋巴细胞分离液浓度为1.077 g/ml，上层分别贴壁流入等量骨髓稀释液，封口，控制温度4℃，离心机转速为2000 r/min，离心20min去除上层脂肪细胞，吸取中间交界处白膜层细胞，然后用4℃的 10 ml DMEM/F12混匀洗涤界层细胞，再次离心20min，转速2000r/min，去除上清液，重复上述洗涤界层细胞步骤1次；用含15% FBS、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 链霉素的DMEM/F12培养基5ml重悬沉积物；步骤2、台盼蓝染色测定细胞活力：取0.4g台盼蓝，加入100 ml的0.1 M PBS溶液中，配制成0.4%台盼蓝溶液，0.1M PBS溶液配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H2O 3.488g，KH2PO4 0.2g，加三蒸去离子水至1000 ml，调整PH值为7.4，0.22 µm滤膜过滤除菌；取0.4%台盼蓝溶液0.5 ml、DMEM/F12培养基0.3 ml 和细胞悬液0.2 ml 充分混匀，未着色细胞为活细胞，着色细胞为死细胞，用血球计数板计数活细胞和死细胞，共计数500个细胞，计算细胞活力，细胞活力( %) = (细胞总数－着色细胞数) /细胞总数×100%；如台盼蓝染色细胞活力≥95%，则可进行下一步操作，否则重复步骤1；步骤3、培养贴壁的BMMSCs：首次培养时用含15% FBS、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 链霉素的DMEM/F12培养液调整细胞密度，以1×106/ml细胞密度5 ml的培养液接种于25 cm2的一次性细胞培养瓶内，置于温度37℃，5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，培养3天后首次换液，去除红细胞、悬浮生长的骨髓造血干细胞及其它未贴壁的骨髓干细胞，以后每隔3天换液1次，即换新鲜的含有15% FBS、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 链霉素的DMEM/F12培养液，待细胞生长至70%～80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化2～3min，用含10%的FBS及双抗的DMEM/F12终止消化，反复吹打瓶壁细胞，制成单细胞悬液按1:3传代，倒置显微镜逐日观察，直至贴壁细胞彼此融合铺满瓶底时，重复上述操作，反复传代扩增，收集；步骤4、培养悬浮生长的HSCs：由于HSCs在体外悬浮生长，且需要基质细胞支持的生长环境，因此在步骤3培养BMMSCs的过程中，在第二次换液时，弃去细胞瓶内的全部上清液，加入由步骤1、2所得到的细胞悬液，用含10% FBS及双抗的DMEM/F12培养液调整细胞密度为1×106/ml，吸取5 ml细胞悬液直接接种于贴壁细胞层的上面，此后每6天半量换液，即从培养瓶中取出2.5 ml细胞培养悬液，离心20min，转速2000r/min，收集细胞沉淀即为HSCs，然后再加入2.5 ml的含10% FBS及双抗的DMEM/F12培养液，按此法继续培养下去，倒置显微镜观察细胞生长情况，直到帖壁的BMMSCs生长至80%融合时，可同时收集悬浮生长的HSCs和帖壁生长的BMMSCs；步骤5、细胞鉴定：(1) 形态学鉴定：倒置显微镜下观察贴壁生长的BMMSCs呈长梭形或多边形的纤维细胞状，悬浮生长的HSCs呈圆形，细胞光亮，折光性好；(2) 流式细胞术鉴定：分别取培养的BMMSCs和HSCs，用PBS制成300µl含有2.5×106个的单细胞悬液；分装至6只1.5ml的Eppendof 管中，分别加入50µl羊血清封闭30min；再分别加入鼠源一抗CD14、CD34、CD44、CD11a、HLA2DR及对照PBS各5µl，混匀，反应30min；PBS离心洗涤2次，去除未标记上的抗体；各管用PBS配制成99µl细胞悬液；每管再加入1µl FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L) 二抗，混匀，37℃下避光反应15min；PBS离心洗涤2次；每管再加入1ml PBS重新混悬细胞，用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD14、CD34、CD44、CD11a和HLA2DR的表达；BMMSCs强表达CD44，HSCs强表达CD34；步骤6、BMMSCs和HSCs的冻存及复苏：(1) 冻存：每代的BMMSCs和HSCs，除用于延续培养和进行相关实验所有外，全部冻存；细胞冻存液：10% DMSO，40% FBS，50% DMEM/F12维持培养液调整细胞浓度为1×106/ml，加入无菌的细胞冻存管中，每管1.5 ml，应用程序降温仪冻存于液氮中；(2) 复苏：从液氮中迅速取出细胞冻存管，立即置入37℃水浴箱，轻轻摇动使其尽快融化，取出冻存管，用75%乙醇消毒后开启，吸出细胞悬液，注入离心管，转速2000r/min，离心20min，去除上清液，用含10% FBS及双抗的DMEM/F12培养液培养液重悬细胞沉淀，置温度37℃，5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。