[发明专利]基于磁性分离和多色量子点标记的人流感病毒分型检测的方法和试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于磁性分离和多色量子点标记的人流感病毒分型检测的方法和试剂盒，其中，该试剂盒由具有富集人流感病毒抗原功能的抗人流感病毒免疫纳米磁珠、多色量子点标记的抗人流感病毒纳米探针、质控品、样品处理液以及PBST缓冲液所组成；质控品包括阳性质控品以及阴性质控品；阳性质控品由灭活的人甲、乙流感病毒共同干燥结合到拭子上而成；阴性质控品是经临床确定为人甲、乙流感病毒均为阴性的人群的咽拭子。本发明提供了一种基于磁性分离和多色量子点标记的能简便、快速、高灵敏度的分型检测人流感病毒抗原的检测方法和试剂盒，以及该试剂盒的制备及使用方法。

主权项

一种用于制备基于磁性分离和多色量子点标记的人流感病毒抗原分型检测试剂盒的方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：1)抗人流感病毒免疫纳米磁珠的制备：1.1)取5mg磁珠，用1ml MES缓冲液洗涤三次，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清；所述磁珠是以超顺磁性Fe3O4为内核、粒径为1150nm的羧基磁珠；所述MES缓冲液是质量浓度是2g/L的2‑(N‑吗啉代)乙磺酸；所述MES缓冲液的pH＝6.0；所述纳米磁分离器的磁性强度是0.4T；1.2)依次加入用步骤1.1)中的MES缓冲液配制的浓度是8‑12mg/ml的EDC溶液以及用步骤1.1)中的MES缓冲液配制的浓度是6‑10mg/ml的sulfo‑NHS溶液各0.5ml，以10‑40rpm于旋转混合仪中活化1hr，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，用1ml步骤1.1)中的MES缓冲液重悬，得到活化后的磁珠；1.3)取5个离心管，在每个离心管中加入200μL步骤1.2)所得到的活化后的磁珠，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，向各离心管中加入用PBS缓冲液稀释的浓度为50‑200μg/ml的兔抗人甲型流感病毒NP蛋白多克隆抗体溶液各1ml，室温下以15rpm于旋转混合仪中反应2‑6h，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清后，各加入1ml含1mg/ml乙醇胺的上述PBS缓冲液，室温下以15rpm于旋转混合仪中反应2h以封闭磁珠上未与抗体反应的羧基；所述PBS缓冲液中各成分含量如下：8g/L NaCl，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，所述PBS缓冲液的pH＝7.4；1.4)封闭反应完成后，将该5个离心管置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，各用1ml洗涤缓冲液洗涤三遍；所述洗涤缓冲液中各成分含量如下：8g/L NaCl，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，0.5ml/L Tween‑20，所述洗涤缓冲液的pH＝7.4；1.5)向各个离心管中分别加入1ml保存缓冲液重悬磁珠，置于4℃保存备用，至此制得抗人甲型流感病毒免疫纳米磁珠；所述保存缓冲液中各成分含量如下：8g/L NaCl，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4，1.44g/L Na2HPO4，0.3g/L NaN3，5g/L牛血清白蛋白，所述保存缓冲液的pH＝7.4；1.6)按与步骤1.1)‑1.5)相同的方法利用兔抗人乙型流感病毒NP蛋白多克隆抗体制得抗人乙型流感病毒免疫纳米磁珠；将上述两种免疫纳米磁珠悬液按体积比1:1混合，即制得抗人流感病毒免疫纳米磁珠；2)多色量子点标记的抗人流感病毒纳米探针的制备：其具体制备方法包括：2.1)向微量离心管中依次加入4nmol羧基水溶性量子点、600nmol N‑羟基硫代琥珀酰亚胺sulfo‑NHS以及600nmol碳二亚胺EDC，以磷酸盐缓冲液定容为2ml，混合溶液，37℃反应30min后，透析去除过量的作为活化剂的sulfo‑NHS及EDC，得到活化后的量子点；所述羧基水溶性量子点的发射波长是520nm；所述磷酸盐缓冲液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠；所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.4；2.2)在步骤2.1)所得到的活化的量子点中，加入4‑16nmol的鼠抗人甲型流感病毒NP蛋白单克隆抗体，避光反应2h，加入单端氨基化聚乙二醇PEG2000‑NH2至终浓度为1％，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h；2.3)用0.2μm PES滤器过滤除去步骤2.2)中的抗体聚集物，然后将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，除去未发生偶联反应的抗体和反应中的副产物；2.4)收集步骤2.3)中超滤离心管滤膜上层量子点‑抗体偶联物溶液，溶于2ml磷酸盐洗涤液中，再将此溶液转移到一个新的50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，收集超滤离心管滤膜上层量子点‑抗体偶联物溶液，溶于1ml磷酸盐保存液中，置于4℃保存备用，至此制得量子点标记的抗人甲型流感病毒纳米探针；所述磷酸盐洗涤液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠，5ml/L吐温‑20，0.3g/L叠氮钠，所述磷酸盐洗涤液的pH＝7.4；所述磷酸盐保存液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，10g/L牛血清白蛋白，0.3g/L叠氮钠；所述磷酸盐保存液的pH＝7.4；2.5)按与步骤2.1)‑2.4)相同的方法利用鼠抗人乙型流感病毒NP蛋白单克隆抗体及发射波长为600nm的羧基水溶性量子点制得量子点标记的抗人乙型流感病毒纳米探针；将上述两种含不同发射波长量子点标记的纳米探针的溶液按体积比1:1混合，即制得多色量子点标记的抗人流感病毒纳米探针；3)PBST缓冲液的配制：其具体配制方法包括：取8g NaCl，0.2g KCl，0.24KH2PO4，1.44g Na2HPO4，0.3g NaN3，0.5ml Tween‑20溶解于800ml蒸馏水中，用5M NaOH调整pH至7.4，再定容至1000ml；4)样品处理液的配制：取8g NaCl，0.2g KCl，0.24KH2PO4，1.44g Na2HPO4，0.3g NaN3，5ml Nonidet P‑40，5ml Triton X‑100，用5M NaOH调整pH至7.4，再定容至1000ml；5)质控品的制备：5.1)阳性质控品：阳性质控品由灭活的人甲、乙型流感病毒共同干燥结合到拭子上而成；5.2)阴性质控品：阴性质控品即经临床确定为人甲、乙流感病毒均为阴性的人群的咽拭子。