[发明专利]一种重组人生长激素的制备方法

摘要

本发明公开了一种在大肠杆菌中以包涵体形式表达重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhHGH)的制备方法，其包括如下主要步骤：高压匀浆破碎菌体细胞、包涵体漂洗，尿素变性溶解所述包涵体、控速分级复性该包涵体蛋白、离心、超滤膜浓缩、过滤除菌、冷冻干燥制成成品等步骤。通过本发明的制备方法所制备的重组人生长激素蛋白具有纯度高、活性高的优点。本发明的制备方法利用蛋白质的控速分级复性进行复性和尿素变性、通过超滤膜技术即可制备纯度高、活性高的重组人生长激素蛋白。同时可以省略层析步骤，大大缩短了工时、降低了生产成本。本发明可高效、简便、低成本地获得rhHGH纯品。

主权项

1.一种在大肠杆菌中以包涵体形式表达重组人生长激素的制备方法，其中，所述的方法包括的步骤如下：1)新发酵获得的重组人生长激素大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≤10℃条件下进行破菌；2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；3)沉淀转移至搅拌罐中，加入10‑30倍含0.1％的曲拉通X‑100的去离子水搅拌，调pH值为7.0，在≤20℃搅拌2小时；4)重复步骤2)和3)2‑3次，得沉淀；5)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比50倍的含1mM Beta‑巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2‑4小时使蛋白变性溶解；6)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5小时，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；7)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入等体积4M的尿素，添加尿素的流速为15mL/分钟，最后尿素浓度降为6M；8)边搅拌边加入步骤7)总量等体积的1M尿素，添加尿素的流速为15mL/分钟，这时尿素浓度为3.5M；9)边搅拌边加入步骤8)总量等体积的纯净水，添加水的流速为15mL/分钟，这时尿素浓度为1.75M；10)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5小时，收集澄清液体；11)用截留分子量为15000道尔顿的超滤机浓缩，到1/8体积；12)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；13)用截留分子量为30000道尔顿的超滤机超滤；14)用截留分子量为15000道尔顿的超滤机浓缩，到1/20体积；15)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。