[发明专利]基于磁性分离和量子点标记的人肺炎支原体快速检测方法和试剂盒

摘要

本发明提供了一种基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎支原体抗原的方法，该方法包括（1）制备抗人肺炎支原体免疫纳米磁珠；（2）制备量子点标记的抗人肺炎支原体纳米探针；（3）将待检样品用PBST缓冲液溶解后，向溶解液中加入抗人肺炎支原体免疫纳米磁珠，充分混合及反应后进行磁分离，以PBST缓冲液洗涤，向得到的沉淀物中加入量子点标记的抗人肺炎支原体纳米探针，反应后磁分离，以PBST缓冲液洗涤后，使用荧光酶标仪检测荧光值。本发明建立了一套准确、快速、高灵敏度的检测人肺炎支原体的方法，其在人肺炎支原体的临床诊断、病原学鉴别、流行病学调查等方面具有很高的实用价值。

主权项

一种用于制备基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎支原体抗原的试剂盒的方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：1）抗人肺炎支原体免疫纳米磁珠的制备：1.1）兔及鼠抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG的制备：1.1.1）重组P1‑His融合蛋白的制备、纯化：1.1.1.1）对人肺炎支原体膜蛋白P1进行生物信息学分析，获取其胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段；1.1.1.2）找到步骤1.1.1.1）中所得到肽段对应的基因编码序列，根据大肠杆菌中密码子的偏好性，对所得到基因编码序列进行密码子优化；1.1.1.3）在步骤1.1.1.2）中所得到的基因序列的5’端及3’端引入酶切位点并化学合成全基因序列，同时标记为p1；1.1.1.4）将步骤1.1.1.3）中所得到的p1按分子生物学方法克隆入表达载体pET‑28a（+）后转入大肠杆菌中表达重组P1‑His融合蛋白；所述重组P1‑His融合蛋白以可溶性表达方式存在于菌体中；1.1.1.5）用镍柱纯化步骤1.1.1.4）所得到的重组蛋白，SDS‑PAGE检测其纯度后，以Bradford法测定蛋白质浓度，调整蛋白浓度为0.2 mg/mL后备用；1.1.2）兔及鼠抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG制备：1.1.2.1）以步骤1.1.1.5）中所得到的重组P1‑His融合蛋白为完全抗原，分别免疫新西兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗人肺炎支原体P1蛋白抗血清及鼠抗人肺炎支原体P1蛋白抗血清；所述兔抗人肺炎支原体P1蛋白抗血清及鼠抗人肺炎支原体P1蛋白抗血清的间接ELISA效价均大于1×105；1.1.2.2）采用Protein G亲和层析柱分别纯化兔抗人肺炎支原体P1蛋白抗血清及鼠抗人肺炎支原体P1蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG；1.1.2.3）用凯基Bradford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1.1.2.2）所得到的二种多克隆抗体IgG的浓度，将其蛋白浓度均调整为1 mg/mL后备用；1.2）免疫纳米磁珠的包被：1.2.1）取 5 mg磁珠，用1 ml MES缓冲液洗涤三次，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清；所述磁珠是以超顺磁性Fe3O4为内核、粒径为180 nm的羧基磁珠；所述MES缓冲液是质量浓度是2 g/L的2‑(N‑吗啉代)乙磺酸；所述MES缓冲液的pH=6.0；所述纳米磁分离器的磁性强度是0.4T；1.2.2）依次加入用步骤1.2.1）中的MES缓冲液配制的浓度是8‑12 mg/ml的EDC溶液以及用步骤1.2.1）中的MES缓冲液配制的浓度是6‑10 mg/ml的sulfo‑NHS溶液各0.5 ml，以10‑40 rpm于旋转混合仪中活化1 hr，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，用1 ml 步骤1.2.1）中的MES缓冲液重悬，得到活化后的磁珠；1.2.3）取5个离心管，在每个离心管中加入200 μL步骤1.2.2）所得到的活化后的磁珠，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，向各离心管中加入用PBS缓冲液稀释的浓度为50‑200 μg/ml的由步骤1.1）所制备的兔抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG溶液各1 ml，室温下以15 rpm于旋转混合仪中反应2‑6 h，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清后，各加入1 ml含1 mg/ml乙醇胺的上述PBS缓冲液，室温下以15 rpm于旋转混合仪中反应2 h以封闭磁珠上未与抗体反应的羧基；所述PBS缓冲液中各成分含量如下：8 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，0.24 g/L KH2PO4，1.44 g/L Na2HPO4，所述PBS缓冲液的pH=7.4；1.2.4）封闭反应完成后，将该5个离心管置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，各用1 ml洗涤缓冲液洗涤三遍；所述洗涤缓冲液中各成分含量如下：8 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，0.24 g/L KH2PO4，1.44 g/L Na2HPO4，0.5 ml/L Tween‑20，所述洗涤缓冲液的pH=7.4；1.2.5）向各个离心管中分别加入1 ml 保存缓冲液重悬磁珠，置于4℃保存备用；所述保存缓冲液中各成分含量如下：8 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，0.24 g/L KH2PO4，1.44 g/L Na2HPO4，0.3 g/L NaN3，5 g/L 牛血清白蛋白，所述保存缓冲液的pH=7.4；2）量子点标记的抗人肺炎支原体纳米探针的制备：其具体制备方法包括：2.1）向微量离心管中依次加入2 nmol 羧基水溶性量子点、300 nmol N‑羟基硫代琥珀酰亚胺sulfo‑NHS以及300 nmol 碳二亚胺EDC，以磷酸盐缓冲液定容为2 ml，混合溶液，37℃反应30 min后，透析去除过量的作为活化剂的sulfo‑NHS及EDC，得到活化后的量子点；所述磷酸盐缓冲液中各成分含量如下：2.9 g/L磷酸氢二钠，0.295 g/L磷酸二氢钠，4 g/L氯化钠；所述磷酸盐缓冲液的pH=7.4；2.2）在步骤2.1）所得到的活化的量子点中，加入4‑12 nmol的步骤1.1）中所制备的鼠抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG，避光反应2 h，加入单端氨基化聚乙二醇PEG2000‑NH2至终浓度为1%，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1 h；2.3）用0.2 μm PES滤器过滤除去步骤2.2）中的抗体聚集物，然后将滤液转移到 50000 MW超滤离心管中，以8000 g离心力在4℃下离心15 min，除去未发生偶联反应的抗体和反应中的副产物；2.4）收集步骤2.3）中超滤离心管滤膜上层量子点‑抗体偶联物溶液，溶于2 ml磷酸盐洗涤液中，再将此溶液转移到一个新的 50000 MW超滤离心管中，以8000 g离心力在4℃下离心15 min，收集超滤离心管滤膜上层量子点‑抗体偶联物溶液，溶于1 ml磷酸盐保存液中，置于4℃保存备用；所述磷酸盐洗涤液中各成分含量如下：2.9 g/L磷酸氢二钠，0.295 g/L磷酸二氢钠，4 g/L氯化钠，5 ml/L 吐温‑20，0.3 g/L 叠氮钠，所述磷酸盐洗涤液的pH=7.4；所述磷酸盐保存液中各成分含量如下：2.9 g/L磷酸氢二钠，0.295 g/L磷酸二氢钠，2 g/L氯化钠，10 g/L 牛血清白蛋白，0.3 g/L 叠氮钠；所述磷酸盐保存液的pH=7.4；3）PBST缓冲液的配制：其具体配制方法包括：取8 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 KH2PO4，1.44 g Na2HPO4，0.3 g NaN3，0.5 ml Tween‑20溶解于800 ml蒸馏水中，用5 M NaOH调整pH至7.4，再定容至1000 ml；4）质控品的制备：4.1)阳性质控品：阳性质控品由灭活的人肺炎支原体干燥结合到拭子上而成；4.2) 阴性质控品：阴性质控品即经临床确定为人肺炎支原体阴性的人群的咽拭子。