[发明专利]一种鉴定新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构的方法

摘要

本发明公开了一种鉴定新红细胞生成刺激蛋白的N‑连接寡糖结构的方法。本发明的方法包括三个步骤：(1)唾液酸酶酶切结合激光诱导荧光毛细管电泳分离的方法来确定新红细胞生成刺激蛋白的N‑连接寡糖上其末端唾液酸的连接方式；(2)糖苷外切酶酶切测序的方法结合激光诱导荧光毛细管电泳分离的方法归属去唾液酸化的N‑连接寡糖的结构；(3)采用激光诱导荧光毛细管电泳和弱阴离子交换色谱的二维分离技术，结合唾液酸酶酶切的方法来分析N‑连接寡糖的结构。本发明的方法灵敏度高、分离度高、操作简单、成本低、准确度高，利于高通量检测和工业化应用，对新红细胞生成刺激蛋白上的N‑连接寡糖结构中占质量分数95％的糖链都进行了结构鉴定。

主权项

1.一种新红细胞生成刺激蛋白的N‑连接寡糖结构鉴定的方法，其特征在于，其包括以下步骤：(1)对新红细胞生成刺激蛋白的N‑连接寡糖进行8‑氨基芘‑1,3,6‑三磺酸三钠盐荧光衍生，衍生产物分为两部分，一部分用广谱性的唾液酸酶α(2‑3,6,8,9)‑specific Neuraminidase进行酶切，另一部分用特异性的唾液酸酶α(2‑3)‑specific Neuraminidase进行酶切，对每一部分的酶切产物分别通过激光诱导荧光毛细管电泳进行分离；从毛细管电泳的结果来确定新红细胞生成刺激蛋白的N‑连接寡糖上末端唾液酸与N‑连接寡糖上唾液酸以外的部分的连接方式；(2)对新红细胞生成刺激蛋白的N‑连接寡糖进行8‑氨基芘‑1,3,6‑三磺酸三钠盐荧光衍生，然后用特异性的唾液酸酶α(2‑3)‑specific Neuraminidase或广谱性的唾液酸酶α(2‑3,6,8,9)‑specific Neuraminidase进行酶切使去唾液酸化，形成中性的N‑连接寡糖；然后将中性的N‑连接寡糖分为三部分，第一部分用β1‑4半乳糖苷酶进行酶切，第二部分用β1‑4半乳糖苷酶和β‑N‑乙酰氨基葡糖苷酶进行酶切，第三部分用β1‑4半乳糖苷酶、β‑N‑乙酰氨基葡糖苷酶和岩藻糖苷酶进行酶切；对每一部分的酶切产物分别用激光诱导荧光毛细管电泳分离；然后分别将每一部分的分离结果中的色谱峰迁移时间转换为葡萄糖单元组成个数；然后结合每一部分所用的糖苷外切酶的特异性，归属所述的中性的N‑连接寡糖的结构；(3)将新红细胞生成刺激蛋白的N‑连接寡糖分为两部分，即第一部分和第二部分；将第一部分先进行2‑氨基苯甲酰胺衍生，然后用弱阴离子交换色谱法对衍生后的产物进行梯度分离，使衍生后的新红细胞生成刺激蛋白的N‑连接寡糖中的中性的N‑连接寡糖、单唾液酸化的N‑连接寡糖、二唾液酸化的N‑连接寡糖、三唾液酸化的N‑连接寡糖及四唾液酸化的N‑连接寡糖达到基线分离；第二部分不经2‑氨基苯甲酰胺衍生，直接用弱阴离子交换色谱法进行梯度分离，且梯度分离的条件同第一部分的梯度分离条件相同，并按照第一部分的分离结果中的衍生后的二唾液酸化的N‑连接寡糖、衍生后的三唾液酸化的N‑连接寡糖及衍生后的四唾液酸化的N‑连接寡糖的出峰时间分别对第二部分的梯度分离后的未经衍生的二唾液酸化的N‑连接寡糖、未经衍生的三唾液酸化的N‑连接寡糖及未经衍生的四唾液酸化的N‑连接寡糖进行收集；对收集的这三种N‑连接寡糖都分别进行以下操作：先脱盐，然后用8‑氨基芘‑1,3,6‑三磺酸三钠盐进行荧光衍生，然后将8‑氨基芘‑1,3,6‑三磺酸三钠盐衍生产物分为两部分，一部分直接进行激光诱导荧光毛细管电泳分离，另一部分先用特异性的唾液酸酶α(2‑3)‑specific Neuraminidase或广谱性的唾液酸酶α(2‑3,6,8,9)‑specific Neuraminidase进行酶切，然后进行激光诱导荧光毛细管电泳分离，通过这两部分的电泳分离结果的对比来分析其结构；所述的步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)之间的顺序不限，其顺序为先步骤(1)，然后步骤(2)，最后步骤(3)；或者是，先步骤(1)，然后步骤(3)，最后步骤(2)；或者是，先步骤(2)，然后步骤(1)，最后步骤(3)；或者是，先步骤(2)，然后步骤(3)，最后步骤(1)；或者是，先步骤(3)，然后步骤(1)，最后步骤(2)；或者是，先步骤(3)，然后步骤(2)，最后步骤(1)。