[发明专利]一种甲基苯丙胺人工抗原的制备方法

摘要

本发明提供了一种甲基苯丙胺人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测：以甲基苯丙胺与丁二酸酐为原料通过化学修饰，接臂，反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备甲基苯丙胺的人工抗原即甲基苯丙胺-牛血清蛋白。所制备的甲基苯丙胺人工抗原可进行动物免疫，取得相应的甲基苯丙胺抗体，可用于各种甲基苯丙胺类免疫分析法的研究，为甲基苯丙胺的检测提供更加方便快速准确的途径。

主权项

一种甲基苯丙胺人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1) 制备人工半抗原：(a) 将盐酸甲基苯丙胺溶于纯化水，滴加DAS溶液，游离使之pH≈9；用乙酸乙酯萃取，减压转干，得到淡黄色油状液体产物Ⅰ；TLC层析液:乙酸乙酯：石油醚 =1: 10（v/v）；(b) 产物Ⅰ加入苯溶解后，置于冰水浴中，滴加三氟乙酸酐880ul，滴加完毕后，室温继续搅拌反应1小时；然后再转入80~85℃的油浴中回流反应3小时；反应结束后，减压蒸干，得粗产物；(c) 粗产物用柱色谱提纯，淋洗剂：乙酸乙酯：石油醚=1：15，展开剂：乙酸乙酯：石油醚 =1: 10（v/v）；收集纯产物，减压蒸干，得淡黄色产物Ⅱ；(d) 产物Ⅱ按比例加入二氯甲烷、丁二酸酐后，转入冰水浴中，分3次加入三氯化铝；固体溶解后转入35‑45℃的油浴中，冷凝回流反应15小时以上；反应结束后，加入13~14mL的冷水，按比例加入盐酸，搅拌均匀后，蒸干；溶于乙酸乙酯，分别用纯化水和饱和氯化钠萃取；有机相减压蒸干，得粗产物；反应比例：产物Ⅱ：丁二酸酐：二氯甲烷：三氯化铝：盐酸=2.3g：1g：20ml：3g：1ml；(e) 粗产物用柱色谱提纯，淋洗剂：乙酸乙酯：石油醚=1/10，1/2, 1/1；展开剂：95%乙醇：氨水：二氯甲烷：1，4‑二氧六环=8: 1: 10: 1（v/v）；收集1/1组分，减压蒸干，得甲基苯丙胺半抗原；    (2) 制备甲基苯丙胺人工抗原：(f) 将甲基苯丙胺半抗原溶于N,N‑二甲基甲酰胺中，加入N‑羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺，反应比例：甲基苯丙胺半抗原：N,N‑二甲基甲酰胺：N‑羟基琥珀酰亚胺：环己基碳酰二亚胺=100mg：5ml：50mg：90mg，室温搅拌反应18小时以上，反应结束后离心取上清液记为A液；(g) 将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2~7.4；(h) 将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为20mg/ml的B液；(i) 将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5，得到的混合液在2‑8℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；(j) 配置0.5%碳酸钠溶液，用2N氢氧化钠调pH=12.00，人工抗原混合液也调至pH=12.00；将人工抗原混合液于上述碳酸钠溶液中透析2天；(k) 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：甲基苯丙胺‑牛血清蛋白。