[发明专利]黄果银桦的离体培养再生植株方法

摘要

本发明公开了一种黄果银桦的离体培养再生植株方法，该方法是采集生长健壮，无病虫害的黄果银桦树冠顶端的半木质化的枝条，清洗后切取2~3厘米的带1~2个腋芽的茎段，将茎段经过消毒、无菌水冲洗，在人为控制条件下诱导腋芽萌发，切取萌发的无菌芽，接种于增值培养基，诱导丛生芽生长，扩大繁殖数量；将丛生芽切成单芽诱导生根，获得完整的组培生根瓶苗，然后将生根的组培瓶苗移入基质中培养，待长出新芽新根后，移植到花盆中培育大苗。本发明方法可克服黄果银桦组培繁殖技术中存在的污染率高、褐化严重、诱导率低、移植成活率低的问题，实现黄果银桦的快速繁殖培育，对山龙眼科银桦属植物在中国园林绿化中的广泛推广有着重要意义。

主权项

一种黄果银桦的离体培养再生植株方法，其特征在于：为以下步骤：（1）采集外植体及材料处理：采集生长健壮，无病虫害的5年生黄果银桦树冠顶端的半木质化的枝条，剪去枝条上的叶片，保留叶柄，装入密封袋里带回试验室；先将枝条用洗洁精溶液泡洗15分钟，泡洗过程中不断摇动瓶子，用流水冲洗干净，再用浓度为95%的酒精浸泡10秒钟，然后用流水冲洗3次，洗净后切成2~3厘米的带1~2个腋芽的茎段；（2）建立无菌繁殖体：①初代培养基的制备：MS1培养基为初代培养基，其制备是将卡拉胶7000mg/L加500ml蒸馏水，加热至卡拉胶完全溶解，然后加入已经预先溶解于水中的培养基配方中的营养元素成分，加水至1000ml，搅拌均匀，pH调至5.8，装瓶、灭菌，备用；所述配方中的营养元素成分及其质量配比如下：6~苄基腺嘌呤2.5mg/L、萘乙酸 0.25mg/L、NH4NO3 1650mg/L、KNO3 1900mg/L、CaCl2·2H2O 400mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、KH2PO4 170mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、NaMoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、肌醇 100mg/L、烟酸 0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素 0.1mg/L、甘氨酸 2.0mg/L、蔗糖 30000mg/L；②将洗净后的茎段在无菌实验室里用75%酒精灭菌1分钟，再用0.1%氯化汞溶液灭菌12分钟，然后用无菌水清洗3~4次，一瓶一个茎段接种于MS1培养基上，在培养室内进行培养，诱导腋芽萌发，当从叶腋萌发出绿芽，经分割、转接并能够使绿芽连续生长繁殖，完成无菌繁殖体的建立；培养条件为：室温20~30℃，每日光照10小时，光照强度1000~1500LX，培养30天；（3）增殖培养：①增殖培养基的制备：MS2培养基为增殖培养基，其制备是将卡拉胶7000mg/L加500ml蒸馏水，加热至卡拉胶完全溶解，然后加入已经预先溶解于水中的培养基配方中的营养元素成分，加水至1000ml，搅拌均匀，pH调至5.8，装瓶、灭菌，备用；所述配方中的营养元素成分及其质量配比如下：6~苄基腺嘌呤 0.1mg/L、萘乙酸 0.2mg/L、活性炭 2.0 g/L、NH4NO3 1650mg/L、KNO3 1900mg/L、CaCl2·2H2O 400mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、KH2PO4 170mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、NaMoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、肌醇 100mg/L、烟酸 0.5mg/L、盐酸吡哆醇 0.5mg/L、盐酸硫胺素 0.1mg/L、甘氨酸 2.0mg/L、蔗糖 30000mg/L；②将获得的无菌繁殖体接种于配制好的MS2的增殖培养基中，放置在人为控制室温为30℃，每日光照10小时，光照强度1600LX的条件下培养32天，从叶腋萌发出无菌绿芽，剪取绿芽接种于增殖培养基MS2上，芽丛增殖，培养30天后，芽丛增殖倍数6倍，在无菌条件下再将其分割转接，经过反复继代培养扩大繁殖；（4）生根培养：①生根培养基的制备：MS3培养基为诱导生根培养基，其制备是将卡拉胶7000mg/L加500ml蒸馏水，加热至卡拉胶完全溶解，然后加入已经预先溶解于水中的培养基配方中的营养元素成分，加水至1000ml，搅拌均匀，pH调至5.8，装瓶、灭菌，备用；所述配方中的营养元素成分及其质量配比如下：萘乙酸 3.0mg/L、活性炭 2.0g/L、NH4NO3 800mg/L、KNO3 900mg/L、CaCl2·2H2O 200mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、Ca(NO3)2 400mg/L、KH2PO4 170mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、NaMoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、肌醇 100mg/L、烟酸 0.5mg/L、盐酸吡哆醇 1mg/L、盐酸硫胺素 0.25mg/L、甘氨酸 2.0mg/L、蔗糖 30000mg/L；②增殖培养过程中，丛生芽高22毫米以上时，将丛生芽从基部切下，分割成单株接种于MS3生根培养基中，放置在室温20~30℃左右，每日光照10小时，光照强度在1800LX的条件下培养22天，苗开始出根，再放置到75%遮荫条件下温室中炼苗10天，生根瓶苗叶片展开，茎芽生长健壮，形成完整植株；（5）移植：①驯化：将培养得到的根系生长良好的瓶苗移入温室驯化，使瓶苗从人为控制培养条件并给予营养元素到适应自然环境条件，并自我吸取养份；②移植：用泥炭土、黄心土和珍珠岩按2:3:1的比例充分混合制得营养基质，填满到育苗杯中，将瓶中的幼苗小心取出，洗净黏在幼苗上的培养基，将幼苗移植到填满营养基质的育苗杯，每一杯种植一株苗，移植覆土深度刚好盖住根系，一般不超过1厘米，压紧基质，使苗根和基质紧密接触，移植完成后淋透定苗水；（6）幼苗培育：移植后的幼苗在一个月内要加强水肥管理及病虫防治，并适当遮荫，保证幼苗成活，当幼苗生长稳定，长出新芽和新根后，逐步增加光照强度，直到进行全光照常规管理，幼苗培育至15厘米高时，移上大一号花盆培育大苗；水肥管理的方法：保持基质湿润，空气相对湿度在95%以上，防止植株失水，培养温度25~28℃，荫棚用75%的遮光网遮光；移植15天之后逐步控制基质水分，相对湿度控制在75~80%，促进新根新芽发生；病虫防治方法：幼苗移植后第三天采用0.1%百菌清喷雾消毒灭菌，之后每隔12天喷雾一次；当有新芽萌发，新根长出时，喷施1500倍营养液，根据幼苗生长状况，每隔半个月喷施一次；所喷施的营养液是由以下配比的药品配制得到：NH4NO3 800mg/L、KNO3 900mg/L、CaCl2·2H2O 200mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、Ca(NO3)2 400mg/L、KH2PO4 170mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、NaMoO2·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L。