[发明专利]一种食源性致病菌分子生物学检测试剂盒的评价方法

摘要

本发明涉及一种分子生物学检测试剂盒的评价技术，尤其涉及食源性致病菌分子生物学检测试剂盒质量评价方法。所述评价方法是基于核苷酸为检测对象的试剂盒定性方法的确认，应验证以下参数：包容性和排他性、相对灵敏度、特异性和准确度、检出限、耐变性和批间变异本发明的食源性致病菌分子生物学试剂盒的评价方法，可以更加客观准确地对此类试剂盒进行必要的技术评价，以保证市场上流通的试剂盒性能指标满足相关要求。

主权项

一种食源性致病菌分子生物学检测试剂盒质量评价方法，其特征在于：所述评价方法是基于核苷酸为检测对象的试剂盒定性方法的确认，应验证以下参数：包容性和排他性、相对灵敏度、特异性和准确度、检出限、耐变性和批间变异；具体验证程序如下：（1）包容性和排他性对试剂盒方法的包容性和排他性测试时，沙门氏菌需要测试包括参考菌株和分离菌株在内的100株目标菌株和50株非目标菌株；其他致病性细菌测试包括参考菌株和分离菌株在内的30株目标菌株和20株非目标菌株；（2）相对灵敏度、特异性和准确度A、样品种类要求选择5个食品种类，15个食品类型的样品；B、样品制备要求1）人工污染样品制备方法a.污染水平每种食品基体需要有3个污染水平样品，标准的测试组分为25g，其中一个未污染、一个样品的污染水平为POD值在0.25～0.75、一个样品的POD值为1.00，其中POD值为0.25～0.75的目标菌浓度为0.2～2cfu/25g、POD值为1的目标菌浓度为4～6cfu/25g；必要时调整水平使部分检测结果呈阳性；b.竞争菌群至少1种食品必须采用竞争菌群进行检测；如果采用人工污染的方式，竞争菌株浓度必须比目标菌至少高10倍；c.污染方式液体样品：在大体积的样品中加入稀释的目标菌，混匀；干样：在样品中加入冻干菌，混匀；固体/湿润的样品：滴加稀释的目标菌，均质、喷雾；要求进行大体积接种；在采用准备好的培养基接种时应保证样品基体不发生变化；小心操作以免样品基体被接种体稀释；2）自然污染样品要求2个不同批，每批20次平行检测；至少1批要求有部分回收率数据；对于每份基体的每个水平，均需分别采用LAMP方法与参考方法进行测试；3）样品测试数量      选择人工污染样品或自然污染样品共计15种食品基质样品，对于低和高的污染水平，分别进行20次平行测试,未接种的样品进行5次平行测试，同时用参考方法进行验证，以检测方法的重复性；（3）检出限计算每种食品基体分别采用试剂盒方法与参考方法的POD值；POD值为检出阳性结果占所有检测结果的比率，包括PODR‑参考方法的POD值、PODc‑采用试剂盒方法检测的POD值；，其中x为检出阳性结果次数，N为测定总次数；    POD值>0.5时，25g基质中的菌含量即为方法的检出限；（4）耐变性A、试验菌株和测试数量采用纯培养的1株目标菌与1株非目标菌进行耐变性实验，目标菌的浓度在POD值为0.25～0.75的水平；每种测试条件10次平行，目标菌采用检测方法所要求的培养基；非目标菌采用非选择性培养基进行培养；采用试剂盒方法进行分析，报出每种条件下检测的POD值；B、耐变因素选择   确定需要评价的变量2个：反应温度和反应时间，每个变量取两个不同的水平；C、结果判断   如果当实验条件改变， POD值<0.9，表明该条件对检测结果有重要影响；（5）批间变异采用纯培养的1株目标菌与1株非目标菌进行批间变异实验，目标菌的浓度在POD值为0.25～0.75的水平；目标菌采用检测方法所要求的培养基；非目标菌采用非选择性培养基进行培养；采用试剂盒方法进行分析，取3个不同批号的试剂盒产品进行检测，每种测试条件10次平行，报出每种条件下检测的POD值；如果不同批次实验结果的 POD值出现<±0.1的偏差，表明试剂盒产品批次间差异不显著，POD值偏差>±0.2, 表明试剂盒产品批次间差异显著；（６）协同验证选择1种食品，添加目标菌，制备未接种、低、高三个接种水平样品，每一水平8个平行样品；同时用试剂盒方法和参考方法进行测试，至少8家实验室进行协同实验。