[发明专利]一种抗肿瘤化合物筛选模型的建立方法及其应用

摘要

一种以体轴向背侧弯曲为标识的高通量逆转斑马鱼Sonic Hedgehog(Shh)信号通路过表达抗肿瘤化合物筛选模型的建立方法及其应用，属于医药技术领域技术创新，能够运用于潜在特异性的肿瘤抑制前导化合物的初步快速筛选。具体为讲斑马鱼tulp3基因作为靶基因，利用特异性Morpholino寡聚核苷酸序列将tulp3基因部分沉默，从而使Shh通路过表达。所述Shh通路过表达斑马鱼表现出体轴特异性向背侧弯曲的表型，此表型即为Sonic hedgehog通路过表达的标识。通过斑马鱼身体外观水平的观察就可以直观了解到Shh通路的过表达情况，相对于细胞模型更加直观和方便，有利于高通量筛选以Shh通路为靶点的药物。

主权项

一种以体轴向背侧弯曲为标识的高通量逆转斑马鱼Sonic Hedgehog(Shh)信号通路过表达抗肿瘤化合物筛选模型的建立方法，其特征在于，所述步骤包括：(1)Morpholino吗啡琳寡聚核苷酸的合成：Morpholino吗啡琳寡聚核苷酸特异序列具体为5’‑TGCAGTATGTTTGTACCGTCGAGTA‑3’。(2)斑马鱼品系选择：选择野生型AB品系作为实验用鱼。(3)斑马鱼胚胎收集，具体步骤：3.1)斑马鱼胚胎的繁殖以自然成对交配的方式进行，每次交配准备6～10对成年斑马鱼，平均每对能产200～300个胚胎。3.2)收取受精后0.75小时内的斑马鱼胚胎。3.3)在28.5±0.5℃条件下，孵育胚胎。(4)Morpholino寡聚核苷酸的显微注射：4.1)注射前一天，选取30条优质成年斑马鱼进行人工交配，雌雄比例为1:2。4.2)挑出死卵和未受精卵，收集高质量的单细胞受精卵。4.3)制作显微注射针。4.4)配置不同浓度的显微注射液。4.5)制作显微注射盘。4.6)Morpholino寡聚核苷酸的显微注射：选取单细胞期的斑马鱼胚胎进行Morpholino的显微注射，每组注射200枚斑马鱼胚胎，每枚胚胎注射剂量为8ng的Morpholino寡聚核苷酸。(5)胚胎饲养及护理：5.1)在注射后的各实验组斑马鱼胚胎中加入新鲜的胚胎培养液，并放入28.5±0.5℃恒温培养箱中进行培养。5.2)及时挑出培养液中的死胚胎，并定时人工更换斑马鱼胚胎培养液，更换培养液的发育时相点为1.5hpf、6hpf、24hpf。(6)表型初步观察：6.1)在体式显微镜下选取10hpf、24hpf、30hpf的发育时相点进行观察。6.2)出现体轴向背侧弯曲的特异表型时，开始在体式显微镜明视场中统计特异表型。(7)图像获取及统计：7.1)斑马鱼胚胎早期人工破膜。7.2)将破膜之后的胚胎进行麻醉，然后置于甲基纤维素中，在体式荧光显微镜下进行拍照。7.3)随机取20尾斑马鱼在体式显微镜下进行拍照并保存图片。7.4)对表型进行统计，观察体轴向背侧弯曲的特异表型的出现比例及体轴弯曲程度。