[发明专利]利用微量溶血分光光度法测定气管炎疫苗免疫活性的方法

摘要

本发明涉及测定气管炎疫苗免疫活性的技术领域，尤其是一种利用微量溶血分光光度法测定气管炎疫苗免疫活性的方法，包括如下工艺步骤：试验准备→免疫→脾细胞悬液制备→SRBC悬液配制→补体制备→抗体形成细胞检测→统计学分析→不同浓度气管炎疫苗免疫。本发明工艺将溶血空斑形成试验和分光光度法测定抗体形成细胞两种方法进行优化和创新，建立了微量溶血分光光度法测定抗体形成细胞。反应在96孔细胞培养板内进行，用酶标仪一次大量检测样品；本发明工艺经过经过多次重复均能得出相应结果，固采用该方法科学、准确，重复性好。

主权项

一种利用微量溶血分光光度法测定气管炎疫苗免疫活性的方法，其特征在于，包括如下工艺步骤：(1)试验准备：a.供试品：制备气管炎疫苗：将甲型溶血性链球菌、白色葡萄球菌、奈瑟氏双球菌经培养基培养采集后用甲醛杀菌，经离心洗涤后按照三种菌等量浓度混合，经PBS稀释而成；b试验对象：50只雄性BABL/C小鼠，5～6的周龄，体重为18～22g，以及5只体重为250‑300g的豚鼠，其中，小鼠共分5组，每组10只小鼠，具体为：第一组：绝对空白对照组；第二组：羊红细胞对照组；第三组：气管炎疫苗第一试验组；第四组：气管炎疫苗第二试验组；第五组：气管炎疫苗第三试验组；c.试验溶液：无菌脱纤维绵羊血，D‑PBS，pH7.2‑7.4；d.试验仪器：显微镜，酶标仪，高速冷冻离心机；(2)免疫：将第二组到第五组的小鼠分别用生理盐水和气管炎疫苗在第一天、第七天、第十四天颈背部皮下进行0.5ml/只的免疫，且这些小鼠在第22天腹腔内注射20％浓度绵羊红细胞悬液0.2ml/只，4天后将小鼠断颈脊髓处死，取脾脏；(3)脾细胞悬液制备：将步骤(2)中收集到的脾脏经研磨、过滤，使其成为单个脾细胞，用D‑PBS溶液洗涤并配制成2.9×107/ml的细胞悬液；(4)SRBC悬液配制：取绵羊血，经无菌生理氯化钠溶液1500rpm离心10min洗涤3次，分别配制成20％和1％的积压绵红细胞悬液；(5)补体制备：取3～5只未免疫豚鼠，采血分离血清后混合，取压积SRBC，按SRBC与豚鼠血清1∶3的比例加入压积SRBC，混匀，置4℃冰箱30min，2000r/min离心10min去除SRBC，以吸收豚鼠血清中存在的抗SRBC抗体；(6)抗体形成细胞检测：取96孔板，依据分组要求，按生理盐水200ul，1％绵羊红细胞100ul，补体100ul，脾细胞100ul加入1ml离心管中，37℃孵育1h，在冰浴条件下停止反应，2000rpm离心10min，取上清150微升至96孔细胞板，酶标仪450nm读数；(7)统计学分析：应用SPSS17.0软件进行统计学分析，各实验组与对羊红细胞对照组采用t检验，以p＞0.05为无统计学差异；以p＜0.05为有统计学差异；p＜0.01为有非常显著性差异；(8)不同浓度气管炎疫苗免疫：将含菌6×108/ml的气管炎疫苗对倍稀释至0.375×108/ml，共分成5组作为实验组同时与羊红细胞组、空白组，按上述试验操作方法进行。