[发明专利]可溯源性非荧光标记大肠杆菌及其制备方法在审
| 申请号： | 201410461450.0 | 申请日： | 2014-09-11 |
| 公开（公告）号： | CN105420173A | 公开（公告）日： | 2016-03-23 |
| 发明（设计）人： | 陈声;郭九标;林大川 | 申请（专利权）人： | 香港理工大学深圳研究院 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19 |
| 代理公司： | 深圳中一专利商标事务所 44237 | 代理人： | 张全文 |
| 地址： | 518000 广东省深圳市南山区高新技术*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | 本发明提供了一种可溯源性非荧光标记大肠杆菌的制备方法，包括：以pKD4为模板PCR扩增得到含有与待改造大肠杆菌manX基因同源序列的FRT cassette产物；将pKD78质粒转入待改造大肠杆菌中，获得含有pKD78质粒的大肠杆菌；将FRT cassette产物转入含有pKD78质粒的大肠杆菌中进行定点重组，形成重组大肠杆菌；通过自杀质粒pCP20敲除所述重组大肠杆菌染色体FRT cassette中的卡那霉素抗性基因。本发明的方法进行改造后的大肠杆菌的基因组中最终只在定点位置留下一个不多于50个核苷酸的FRT痕迹，大大降低了插入序列对宿主菌的影响，并且不会改变置入宿主后导致抗性特点的传播，并且该FRT痕迹能方便后续该改造菌株的跟踪溯源。 | ||
| 搜索关键词： | 溯源 荧光 标记 大肠杆菌 及其 制备 方法 | ||
【主权项】：
一种可溯源性非荧光标记大肠杆菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以pKD4为模板，通过pKD4扩增引物PCR扩增，得到含有与待改造大肠杆菌manX基因同源序列的FRT cassette产物；其中所述pKD4扩增引物包括上游引物HP1和下游引物HP2；所述上游引物HP1具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列，所述下游引物HP2具有序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列；将pKD78质粒转入待改造大肠杆菌中，获得含有pKD78质粒的大肠杆菌；将所述FRT cassette产物转入含有pKD78质粒的大肠杆菌中进行定点重组，形成重组大肠杆菌；通过自杀质粒pCP20敲除所述重组大肠杆菌染色体FRT cassette中的卡那霉素抗性基因。
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