[发明专利]成人骨髓中Muse细胞诱导为神经前体细胞的方法

摘要

本发明涉及细胞生物学技术领域，提供了一种从成人骨髓中分离得到Muse细胞，并体外诱导为Muse‑NPCs的方法，并从形态观察、细胞表型、多向分化能力以及成瘤性等方面对Muse细胞以及诱导形成的Muse‑NPCs进行了鉴定，采用本发明的方法培养得到的Muse细胞及Muse‑NPCs的相关分子标识确是完全的表达。本发明还提供了根据该方法从成人骨髓中分离得到的Muse细胞，以及Muse细胞诱导分化得到的Muse‑NPCs。本发明在体外成功诱导形成Muse‑NPCs，其持续增殖、多向分化和自体来源的特性可以为今后神经损伤的细胞治疗和组织工程治疗提供新的良好的种子细胞。

主权项

1.一种从成人骨髓中分离Muse细胞并诱导分化为神经前体细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：A、从成人骨髓中分离、培养Muse细胞：将健康成人骨髓2‑3ml，用PBS等体积稀释骨髓后，缓慢加在3ml Histopaque‑1077上方，2000rpm离心30min，吸出第二层云雾状薄膜层，加入PBS洗涤2次后用DMEM/F12完全培养基重悬细胞，以5×105/ml的密度种于培养皿中，37℃、5％CO2的培养箱中培养；24h后BMSCs贴壁，倒去悬浮的未贴壁细胞，加入新的DMEM/F12完全培养基常规培养7d；用0.25％Trypsin‑EDTA重悬贴壁细胞，并以105/ml的密度接种于培养皿中培养8h，终止胰酶反应后洗涤，MC培养基重悬细胞，以8×103/ml的密度，每孔1ml接种于预先经过polyHEMA包被处理的24孔板中常规培养，4d后形成Muse细胞球；所述的DMEM/F12完全培养基的配方为：DMEM/F12、15％胎牛血清和1％青霉素‑链霉素双抗；所述的MC培养基配方为：DMEM/F12、20％胎牛血清、1％青霉素‑链霉素双抗和0.9％MethoCult；B、Muse细胞的扩增和传代：将Muse细胞球吸出移入离心管，1000rpm离心5分钟至10分钟，加入0.25％Trypsin‑EDTA消化5分钟至8分钟，终止胰酶反应后洗涤，DMEM/F12完全培养基吹打成单细胞悬液，以105/ml的密度接种至培养皿中常规培养，可见Muse细胞贴壁生长，数量扩增，4天后用0.25％Trypsin‑EDTA重悬贴壁细胞，终止胰酶反应后洗涤，MC培养基重悬细胞，以8×103/ml的密度，每孔1ml接种于预先经过polyHEMA包被处理的培养板中常规培养，2天即可见Muse细胞球形成；C、Muse细胞的鉴定：光镜观察Muse细胞球形成情况；流式细胞仪鉴定Muse细胞的细胞表型；免疫荧光细胞化学技术和RT‑PCR技术检测Muse细胞球的多能干细胞标记物表达情况；免疫荧光细胞化学技术和RT‑PCR技术检测Muse细胞向三个胚层分化的能力；D、体外诱导Muse分化成神经前体细胞Muse‑NPCs：将Muse细胞球吸出后用0.25％Trypsin‑EDTA消化5分钟至8分钟，终止胰酶反应后1000rpm离心5分钟至10分钟，用神经诱导培养基重悬细胞，反复吹打成单细胞悬液，以5×104/ml的密度接种于培养皿中，常规培养7天后可见Muse‑NPCs细胞球形成；所述的神经诱导培养基的配方为：DMEM/F12、1％青霉素‑链霉素双抗、1％B27、20ng/ml EGF和20ng/ml bFGF；E、Muse‑NPCs的鉴定：光镜观察Muse‑NPCs的细胞球形成情况；免疫荧光细胞化学技术和RT‑PCR技术检测Muse‑NPCs的多能神经干细胞标记物表达情况。