[发明专利]基于微卫星标记和隶属函数法研究玉米种质的耐深播性

摘要

基于微卫星标记和隶属函数法研究玉米种质的耐深播性，主要步骤：（1）采用PVC管进行深播试验，在3cm、15cm和20cm三种播深处理下共同探讨耐深播性与相关性状的关系，筛选出耐深播鉴定指标及适宜的筛选深度。（2）利用隶属函数法评价各自交系的耐深播性大小。（3）利用70对多态性微卫星标记分析51份自交系的耐深播遗传多样性。（4）结合自交系在三种播深下的性状表现，耐深播性评价结果及耐深播种质微卫星标记结果来挖掘玉米耐深播种质类群。此方法从形态学和分子生物角度研究了玉米种质的耐深播性，重复性强，结果可靠，能够大大提高耐深播种质筛选与应用效率。

主权项

基于微卫星标记和隶属函数法筛选玉米耐深播种质的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）收集材料：收集51份玉米自交系材料；（2）种子清选：在51份材料中分别选取饱满一致、无破损的种子10粒各10份；（3）深播试验：采用PVC盆栽试验法，往尼龙网封底的高40cm、直径15cm 的PVC管中分层装入蛭石，然后分别将步骤（2）所得的51份自交系的种子10粒均匀地播于蛭石上，再分别盖3cm、15cm和20cm蛭石使管内蛭石高度达40cm；其中3cm为对照处理，15cm和20cm为两个深播处理，每一处理3次重复，播前统一配土、装钵、浇水；在室内条件下萌发10天后统计出苗率，每一处理选取整体一致的幼苗6株测定其胚芽鞘长、中胚轴长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长及根长；（4）培养黄化苗：51份自交系各取10粒种子先用ddH2O清洗2次，再用体积百分比为75%的酒精消毒10min，最后用ddH20冲洗3次，将种子放在灭过菌且铺有两层滤纸的培养皿上，浇适量ddH2O，放置培养箱中25℃进行暗培养，待黄化苗长至3~5cm时迅速剪其黄化苗，装入自封袋中编号，‑70℃保存；（5）DNA提取：用CTAB法提取步骤（4）所得的自交系黄化苗全基因组DNA，用质量百分比为1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用德国IMPLEN微量分光光度仪检测DNA浓度；（6）筛选SSR标记：从玉米基因组数据库网站中选择了均匀分布于玉米全基因组的230对SSR引物，由上海生工生物工程有限公司合成；（7）PCR扩增：选择黄早四、掖478、丹340、齐319、Mo17和B73这6份国内玉米杂种优势群的标准测验种为多态性SSR引物筛选材料，用步骤（5）所得的这6份自交系的DNA 在Biometra‑T1PCR仪上进行PCR反应，所述PCR反应采用10反应体系，包括Mix5.0，1mmol/L正、反SSR引物各0.3，ddH2O 3.7，50ng/DNA0.7；PCR反应程序为：95℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，50‑59℃退火30s，72℃延伸30s，共36个循环；最后72℃延伸10 min，4℃结束并保存；扩增产物用质量百分比为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染；若上述6份自交系PCR扩增产物在两份或两份以上自交系间有差异，则认为这对引物为多态性引物，总共筛选出了70对条带清晰、多态性好的SSR引物，所述SSR引物如序列表SEQ ID NO:1‑140所示；（8）耐深播种质的微卫星标记：用步骤（7）所得的70对SSR引物和步骤（5）所得51份自交系的DNA在Biometra‑T1PCR仪上进行步骤（7）的所述的PCR反应，将扩增产物用质量百分比为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染；用NTYSY‑pc2.1软件分析51份自交系的耐深播遗传多样性并划分种质类群；（9）结果分析：对步骤（3）测得的数据用统计软件SPSS16.0的相关程序进行方差分析、相关分析，确定玉米耐深播性鉴定指标为出苗率、胚芽鞘长、中胚轴长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长及根长及适宜的筛选深度为15cm和20cm，利用隶属函数法对51份自交系的耐深播性进行分类评价，取该两种筛选深度下的隶属值的平均值进行评价：隶属值﹥0.55是强耐深播类型，隶属值在0.45‑0.55之间是中等耐深播类型，隶属值＜0.45是弱耐深播类型；结合自交系在三种播深下6个鉴定指标的性状表现、耐深播性类型及耐深播种质微卫星标记结果来挖掘玉米耐深播种质类群；其中，所述的利用隶属函数法对51份自交系进行耐深播性分类评价，其公式为：Uij=(Xij ‑ Xjmin)/(Xjmax‑Xjmin)式中：Uij表示i材料j指标的耐深播隶属值；Xij表示i材料j指标的测定值；Xjmin表示所有材料j指标的最小值；Xjmax表示所有材料j指标的最大值；累加各指标的具体隶属值，并求出平均值后进行比较，平均值越大，自交系的耐深播性越强。