[发明专利]一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法

摘要

一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，属于分析化学、食品安全检测技术领域。本发明将氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶构建了双酶偶联体系；氨基甲酸乙酯降解酶将氨基甲酸乙酯水解生成乙醇、水和氨，在谷氨酸脱氢酶催化下氨与共底物α-酮戊二酸反应生成谷氨酸，同时伴随着还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被氧化。从而该体系将氨基甲酸乙酯含量转化成NADH含量的变化，利用NADH在340nm处吸光值的变化，实现对液态体系中氨基甲酸乙酯含量的检测。该方法能够快速检测溶液及模拟黄酒体系中的氨基甲酸乙酯，检测限低至0.1μmol·L^-1，为发酵食品和饮料中氨基甲酸乙酯的检测提供了有效的手段。

主权项

一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，其特征在于步骤为：（1）构建双酶偶联催化体系a、酶源：氨基甲酸乙酯降解酶，对氨基甲酸乙酯EC降解酶产生菌菌株CGMCC No.5763细胞培养后经超声破碎、离心、浓缩、凝胶层析、超滤浓缩后所得；谷氨酸脱氢酶则为市售商品酶；b、酶液以及其他溶液的制备：用25mmol·L^‑1 PBS缓冲液溶解氨基甲酸乙酯降解酶以及谷氨酸脱氢酶，使得二者酶活分别为16U·mL^‑1及10U·mL^‑1；配制540mmol·L^‑1α‑酮戊二酸溶液；7.5mmol·L^‑1NADH以及不同浓度的氨基甲酸乙酯标准溶液；c、双酶偶联体系的构建：向反应体系中分别加入20μL上述氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶溶解液，66μL的α‑酮戊二酸溶液，20μL NADH溶液，20μL 1mmol·L^‑1 氨基甲酸乙酯溶液和454μL PBS缓冲液，使得总反应体系体积为600μL，置于石英比色皿中混合均匀；然后将此反应体系置于分光光度计中用动力学方法监测溶液中NADH在340nm处吸光值的变化情况；（2）双酶偶联体系对氨基甲酸乙酯含量的快速测定：d．用纯度大于99%的氨基甲酸乙酯配制浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5和1 mmol·L^‑1的母液；e、向双酶偶联体系中加入适当体积和浓度的氨基甲酸乙酯母液使得反应体系中氨基甲酸乙酯浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50 μmol·L^‑1；将所得的溶液体系混合均匀后置于分光光度计中用动力学方法监测NADH在340 nm处吸光值的变化，反应时间为5min；将EC的浓度与340nm处吸光值在5min内的变化制作得到标准曲线；f、向黄酒样品中添加氨基甲酸乙酯母液使得样品中EC含量为5、10、20μmol·L^‑1，在双酶偶联反应体系中反应5min后检测NADH在340nm处的吸光值变化，通过对比标准曲线计算模拟酒样中氨基甲酸乙酯含量。