[发明专利]抗鸭肝炎病毒转移因子的制备方法

摘要

本发明公开了一种抗鸭肝炎病毒转移因子的制备方法。本发明按照以下步骤进行：将鸭肝炎病毒接种于9-11日龄鸡胚或鸭胚的尿囊液制备病毒抗原；提取鸭肝炎病毒抗原；用上述提取的病毒抗原免疫健康猪；从免疫猪体内提取抗鸭肝炎病毒转移因子。因此使用本发明的转移因子可以起到预防鸭肝炎病毒感染、能够保护正常机体细胞免受鸭肝炎病毒侵害的作用，从而降低发病率，具有很好地应用前景。

主权项

一种抗鸭肝炎病毒转移因子的制备方法，其特征在于：该制备方法的步骤如下：(1)制备病毒抗原：将鸭肝炎病毒接种于9‑11日龄的鸡胚或鸭胚尿囊液中，33℃‑37℃温箱孵育，24h内死亡的鸡胚或鸭胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸡胚或鸭胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成悬液，‑20℃—‑40℃冰箱内保存备用；(2)提取病毒抗原：将步骤(1)中得到病毒抗原反复冻融3‑5次后，装入厚壁小瓶子内，超声15‑20min，4℃、5000rpm离心20‑30min，弃去沉淀，收集上清液，将上清液经4℃、7000rpm离心20‑30min，弃去沉淀，收集上清液，经4℃、25000rpm离心20‑30min，弃去上清液，取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15％、30％、45％、60％及80％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4℃、15000‑20000rpm离心2‑4h，根据鸭肝炎病毒的分子量确定鸭肝炎病毒所在位置，吸出并置于‑20℃—‑40℃冰箱内保存备用；(3)用步骤(2)所得提取的病毒抗原免疫猪：挑选健康免疫猪，取制备的病毒抗原，采用皮下多点免疫方法，注射免疫猪，共免疫3‑4次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次和第4次后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫7‑10天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾脏和胸腺于冰上，转移至‑20℃—‑40℃保存，备用；(4)从免疫猪中提取抗鸭肝炎病毒转移因子：①原材料的制备及预处理：取步骤(3)所得的接种鸭肝炎病毒免疫猪的脾脏、胸腺及淋巴结组织，用冷三蒸水洗净猪的脾脏，去除表面筋膜、脂肪等组织，再灭菌生理盐水反复冲洗；②破碎:将洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机以1000r/min捣碎3次，每次3min，制得匀浆液；③冻融:将匀浆液置于‑80℃快速冷冻，水浴30℃中融化，交替冻融4‑8次，每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎；④提取:加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机于5℃以4000r/min离心30min，取上层血红色液体，再用G2砂心漏斗过滤，取滤液；⑤超滤:将上述滤液用截流值为5000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于5000道尔顿的转移因子；⑥除菌:将超滤得到的滤液用孔径为0.1‑0.22um的滤膜加压过滤除菌；⑦分装：4℃密封保存，即得抗鸭肝炎病毒转移因子提取液成品。