[发明专利]利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法

摘要

本发明公开了一种利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法。其技术方案是：葡萄白粉菌菌株小种分离、纯化与侵染；通过rDNA序列扩增与进化分析而获得高致病性的葡萄白粉菌菌株NAFU1；并分析该菌株的保存与扩繁；利用该菌株接种葡萄离体叶片，用台盼蓝染色接种后不同时间病叶，通过观察孢子萌发早晚、生长快慢、菌丝长短及有无细胞坏死出现等指标，快速准确的检测葡萄的抗病性。本发明保存扩繁的白粉菌产孢量大，孢子新鲜，致病性强，克服了传统田间鉴定周期长、重复性差、受气候影响的缺点，不但可以提高大规模检测葡萄种质资源抗病性效率，而且对开展大规模快速鉴定葡萄种质资源及其杂种后代和转基因葡萄植株抗病性具有直接参考价值。

主权项

利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法，其特征是通过以下技术方案实现的：a.葡萄白粉菌菌株小种分离与纯化在葡萄白粉病发病盛期，在葡萄园采集严重感染葡萄白粉菌的叶片，采用单孢分离法，从采摘的病叶经分离纯化获得葡萄白粉菌，并对分离的葡萄白粉菌菌株进行致病性鉴定，选择其中一个菌株感病迅速，致病性强，符合鉴定需要，即为鉴定用葡萄白粉菌菌株小种；b.葡萄白粉菌菌株小种侵染采用压片接种法，用保存的新鲜白粉菌菌株小种接种葡萄健康叶片，检测菌株小种对葡萄的侵染过程；c.葡萄白粉菌菌株小种rDNA序列扩增收集菌株小种纯化后的白粉菌分生孢子，提取该白粉菌基因组DNA，用白粉菌保守区通用引物ITS4和NS7进行PCR扩增，得到菌株小种保守区DNA片段序列；d.葡萄白粉菌菌株小种进化分析用葡萄白粉菌菌株小种保守区DNA片段序列在NCBI进行序列比对及进化分析，表明获得了一个新的葡萄白粉菌菌株；e.葡萄白粉菌菌株小种保存与扩繁采用直接扫落接种在盆栽葡萄叶片上，摩擦接种插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片和喷洒接种插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片三种保存方法，对葡萄白粉菌菌株小种进行保存与扩繁；f.用葡萄白粉菌菌株小种接种葡萄种质资源、葡萄杂交后代及转基因葡萄植株离体叶片鉴定抗病性取葡萄种质资源、葡萄杂交后代及转基因葡萄植株离体叶片，压片接种葡萄白粉菌菌株小种，分别在接种后不同时间段采样，用台盼蓝染色，普通显微镜观察，通过统计孢子萌发及菌丝生长情况，检测葡萄对白粉病抗性。