[发明专利]一种基于mmLDL上调脑基底动脉的ETB受体的方法

摘要

一种基于mmLDL上调脑基底动脉的ETB受体的方法。将大鼠脑基底动脉与mmLDL共培养24小时，考察信号转导通路时，加入相应的信号转导通路抑制剂。使用肌张力描记仪测定微血管张力，使用real-time PCR和Western blot分别检测mRNA水平和蛋白水平。结果，新鲜脑基底动脉环ET_B受体基本不介导收缩，器官培养显著增加ET_B受体介导的收缩，收缩量效曲线左移，同时E_max达到88±6％，与10μg/ml mmLDL共培养，引起收缩量效曲线进一步左移，E_max达到116±12％。mmLDL可以通过激活PKC，MAPK和NF-кB信号转导通路上调脑基底动脉ET_B受体。

主权项

一种基于mmLDL上调脑基底动脉的ETB受体的方法，其特征在于，具体步骤为：步骤一、动脉环的制备及器官培养SD大鼠用CO₂麻醉，断头处死，迅速取出大脑放入冷的碳酸氢盐缓冲液，取出脑基底动脉，显微镜下剥离血管周围组织，血管内插入一根细线机械旋转去除内皮，将处理好的血管切成1mm长的圆环，当乙酰胆碱引起的舒张率＜10％，认为内皮已被去除，血管环在24孔板进行器官培养，每孔2个血管环，每孔加入含100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素的培养液培养24h，在37℃，含5％CO₂和95％O₂的培养箱内培养，由于器官培养本身可以在脑基底动脉诱发ET_B受体上调，在考察mmLDL对ET_B受体的作用时将器官培养组设为一个对照组，LDL组为另一个对照组，预实验脑基底动脉环分别与5，10和20μg/mL的mmLDL共培养，培养时间分别为6，12，24和48h，预实验显示1μL的DMSO加入1mL的DMEM不影响实验结果，为了考察mmLDL对ET_B受体的作应机制，使用了信号转导通路的特异性拮抗剂，PKC通路拮抗剂选用0.1μMstaurosporine，ERK1/2通路拮抗剂为10μMU0126和10μMSB386023，U0126拮抗MAP激酶/ERK激酶1/2，即拮抗MAPKK；SB386023拮抗上游的MAPKKK，特异性的JNK通路拮抗剂为10μMSP600125，p38MAPK通路拮抗剂为10μM的SB203580，NF‑κB通路拮抗剂为10μM的wedelolactone，每一个拮抗剂均与mmLDL同时加入并共培养24h，然后，血管环置入浴槽做血管环张力实验，如果做RT‑PCR或者western blot实验，血管环放入液氮冷冻3小时然后存储于‑80℃冰箱；步骤二、动脉环肌张力实验将脑基底动脉环套在两个L型的金属针上，其中一个连接张力换能器，另一个连微调装置，通过软件Chart5.0以及硬件PowerLab 8通道桥式放大器，将血管所负荷张力显示于屏幕，将安装好的动脉环置入含有5ml Krebs液的37℃Myograph恒温浴槽，持续通入含95％O₂和5％CO₂的混合气体，pH保持7.4，实验前，脑基底动脉环静息负荷1.5mN，每20min换液一次，稳定1h，以含K⁺63.5mM的K⁺‑Krebs液检验动脉环收缩性，两次收缩高度大于1mN且收缩幅度相差＜10％者用于实验，在浴槽中浓度累加法加入10^‑10M‑10^‑7M的S6c，选择性激动ET_B受体，可以得到ET_B受体介导的量效曲线；步骤三、实时定量PCR总的RNA提取使用RNAfast200试剂盒，按照使用说明书提取，提取的RNA逆转录成cDNA使用GeneAmp RNA PCR试剂盒，按照说明书在Perkin‑Elmer公司的DNA热循环仪完成，RT‑PCR在GeneAmp5700扩增仪中进行，使用基因扩增的SYBR Green试剂盒，以cDNA为模版，设立对照组，除不加cDNA外，余平行操作，受体的特异性引物根据基因数据库应用引物表达‑2软件设计，大鼠ET_B受体特异性引物，基因库编号NM_017333，设计如下：前引物：5′‑TGACGCCACCCACTAAGACC‑3′后引物：5′‑GGCACGGAGGAGGGAAGG‑3′Beta‑actin mRNA为官家基因，引物设计如下：前引物：5′‑ACTATCGGCAATGAGCGGTTCC‑3′后引物：5′‑CTGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG‑3′步骤四、Western blotting实验时取出存于‑80℃冰箱的脑基底动脉，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞提取变性缓冲液RIPA裂解液，匀浆，使用BCA蛋白分析试剂盒蛋白定量，使用SDS‑PAGE凝胶分离，电转膜仪转膜至PVDF膜，5％脱脂牛奶封闭，一抗为1∶100稀释的兔抗大鼠ET_B受体抗体，和1∶500稀释的小鼠抗大鼠β‑actin抗体，稀释液为含2％牛血清白蛋白的PBS；二抗为辣根过氧化物酶标记的1∶2000稀释的抗兔IgG和1∶2000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG，图像经Image Gauge Ver.4.0，对光密度进行分析。