[发明专利]一种用于非疾病诊断目的的定量检测内源环状RNA的方法

摘要

本发明公开了一种制备外源环状RNA的方法及定量检测内源环状RNA的方法。本发明将人工合成的DNA基因进行克隆，增殖，之后转录DNA基因为线性RNA，将RNA末端修饰后，首尾连接，制备成外源环状RNA分子。将外源环状RNA分子按特定比例加入总RNA中，作为内源环状RNA实时定量检测时的参考基因，首次实现了对内源环状RNA的实时定量检测。

主权项

一种用于非疾病诊断目的的定量检测内源环状RNA的方法，其特征在于，所述方法包括：制备外源环状RNA，所述制备外源环状RNA的方法包括：选择外源线性RNA基因，所述外源线性RNA基因对应的DNA序列如序列表SEQ ID NO:1所示；将所述外源线性RNA基因克隆到原核表达载体中，获得克隆的外源线性RNA基因；将所述克隆的外源线性RNA基因在体外转录，合成外源线性RNA；去除所述外源线性RNA的5’端的三磷酸结构，并在所述外源线性RNA的5’端合成羟基；对5’端为羟基的所述外源线性RNA进行磷酸化修饰，合成5’端经磷酸化修饰的所述外源线性RNA；将所述5’端经磷酸化修饰的外源线性RNA的5’端和3’端连接，合成外源环状RNA；切掉未环化成功的所述外源线性RNA，得到外源环状RNA；对所述外源环状RNA进行质量控制，利用随机引物对合成的所述外源环状RNA进行逆转录，合成外源cDNA；利用第一引物和第二引物分别对所述外源线性cDNA和所述外源环状cDNA进行实时定量PCR扩增，分别获得CT1值和CT2值，所述第一引物由如序列表中SEQ ID NO:2所示的第一正向引物和如序列表中SEQ ID NO:3所示的第一反向引物组成，所述第二引物由如序列表中SEQ ID NO:4所示的第二正向引物和如序列表中SEQ ID NO:5所示的第二反向引物组成；通过CT1值和CT2值以及公式计算合成的所述外源环状RNA的环化比例，并选用环化比例超过90％的所述外源环状RNA；向待检样本和对照样本的总RNA中加入所述外源环状RNA，所述总RNA与所述外源环状RNA的质量比为2000:1，得到所述外源环状RNA与所述总RNA的混合物；利用实时定量PCR方法分别检测所述外源环状RNA与所述总RNA的混合物中的目标环状RNA和所述外源环状RNA的含量；以所述外源环状RNA为参考基因，确定所述待检样本中所述目标环状RNA的表达量。