[发明专利]一种牛贝诺孢子虫病巢式PCR检测方法

摘要

一种牛贝诺孢子虫病巢式PCR检测方法，涉及一种分子生物学检测方法，该方法以样品DNA为模板，利用虫体的核糖体ITS序列引物B1/B2进行第一轮PCR扩增，再以第一轮PCR产物为模板，通过设计的一对鉴别贝诺孢子虫的特异性引物B3/B4，进行第二轮PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，如果出现393bp的特异性条带，则确定所检测的病原为贝诺孢子虫。本发明的贝病的巢式PCR检测方法，对虫体基因组DNA的检测灵敏度为24.3ag/µL，并且能克服染色镜检和常规PCR等方法的缺点，提供了一种快速、特异、灵敏的贝病的早期诊断的分子生物学方法，对该病的早期检测和有效地预防具有重要的意义。

主权项

一种牛贝诺孢子虫病巢式PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括以下几个步骤：    步骤1）、基因组DNA提取：采用普通DNA提取方法提取贝诺孢子虫DNA；    步骤2）、第一轮PCR扩增：以步骤1）得到的样品DNA为模板，采用虫体ITS序列引物BN1/BN2经PCR扩增得到第一轮PCR产物；BN1序列为：5’‑TGA CAT TTA ATA ACA ATC AAC CCT T‑3’，BN2序列为：5’‑TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC‑3’；     步骤3）、第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增产物为模板，设计贝诺孢子虫特异性引物B3/B4经PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物；BN3序列为：5’‑CCA CCT CCT CAC TCT GCT AT‑3’，BN4序列为：5’‑TCC TCT GTG TTC ATT ATT CC‑3’；     步骤4）、PCR扩增产物检测：取5 µL第二轮PCR扩增产物，加入1µL的6×Loading Buffer，混匀后于1%琼脂糖凝胶中，EB浓度为5 µg/mL， 100 V电压下电泳30 min，凝胶成像系统观察并拍照，存在约393bp的特异性条带，则确定所检测的病原为贝诺孢子虫。