[发明专利]应用于焦磷酸测序的化学修饰引物介导的方向特异性单链DNA制备

摘要

本发明涉及应用于焦磷酸测序的化学修饰引物介导的方向特异性单链DNA制备。具体地说在PCR时一条引物用普通合成的引物，而另一条引物用可以抗酶切的化学修饰引物，PCR扩增后再利用有5’→3’切割功能的外切酶处理双链DNA，将未修饰的DNA单链消化掉，制备方向特异的单链模板DNA。应用这种方法制备单链DNA可以直接用于作为焦磷酸测序的模板，大大降低了焦磷酸测序的成本，减少了测序模板制备的繁琐步骤。

主权项

一种制备用于焦磷酸测序的单链DNA、测序及判断目标DNA甲基化水平的方法，所述方法包括以下步骤：(1)引物设计：根据目标DNA模板设计一对PCR扩增引物，其中一条扩增引物为普通引物；另一条扩增引物为5’末端化学修饰的引物，其不会被具有5’→3’外切酶活性的酶酶切；所述的DNA模板是重亚硫酸氢盐处理的DNA；所述的5’末端化学修饰是5’末端3个碱基进行的化学修饰为硫代磷酸化修饰或其它能够阻断核酸外切酶的化学修饰；所述的具有5’→3’外切酶活性的酶为T7DNA外切酶或Lamda核酸外切酶或其它能够被化学修饰阻断的核酸外切酶；(2)PCR扩增及酶切：利用(1)的扩增引物对目标DNA模板进行PCR扩增，获得扩增产物，该扩增产物中一条链存在5’末端修饰，而另一条链5’末端没有修饰；进行PCR扩增产物液体纯化；利用具有5’→3’外切酶活性的酶对扩增产物进行酶切，5’末端没有修饰的链被酶切降解，进行液体纯化，获得带有5’末端化学修饰的单链DNA产物；和(3)获得的单链DNA产物直接用于焦磷酸测序或sanger测序，判断目标DNA甲基化水平。